祝金波，王 敏，周 林，刘毓玲

湖北省武汉市中医医院检验科，湖北武汉 430050

肾细胞癌是起源于肾实质肾小管上皮的恶性肿瘤，其中透明细胞癌是最常见且恶性程度最高的类型，透明细胞癌患者极易发生肿瘤转移，导致患者预后差[1-2]。肾细胞癌的早期症状不明显，大部分患者发现时已处于中晚期，肾细胞癌采用放疗、化疗治疗效果均不佳[3]。肾细胞癌的发生、发展及转移是一个极其复杂的动态过程，具体机制尚不清楚，目前临床尚未发现能对其进行早期诊断及预后判断的特异性指标，因此，寻找早期诊断及治疗的靶标是肾细胞癌研究领域的热点。近些年研究人员发现微小RNAs(miRNAs)在肾细胞癌的发生、发展过程中具有重要的作用[4-5]。miRNAs是长度约为22个核苷酸的内源性非编码RNA分子，它与生物体的细胞分化、发育、增殖、凋亡等多种生物学过程关系密切[6]。多项研究显示，在肾细胞癌组织中能检测到异常表达的miRNAs，miRNAs在多种肿瘤的发生、发展过程中均发挥着重要的作用[7-9]。本研究分析miR-122和miR-144-3p在肾细胞癌与癌旁组织中的表达差异，及其与病理分期、临床分期等之间的关系，旨在为肾细胞癌的早期诊断、治疗、预后判断提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2017年2月至2019年2月46例在本院泌尿外科行肾脏切除术患者的肾细胞癌组织及其癌旁组织(距癌组织5 cm以上)，并保存于液氮中。所有患者均经术后病理确诊为肾细胞癌，且癌旁组织无癌组织浸润。46例患者中男32例，女14例；年龄25～70岁，平均(53.2±14.6)岁。组织学类型的分类采用世界卫生组织2004年肾细胞癌的病理分类标准，临床分期采用2009年国际抗癌组织和美国癌症联合会的临床分期标准。TNM分期：T1期26例，T2期17例，T3期2例，T4期1例。临床分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期17例，Ⅲ期2例，Ⅳ期1例。本研究通过本院医学伦理委员会批准，患者及家属均签署了知情同意书。

1.2仪器与试剂 PRISM7000实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；UV-2006型紫外分光光度计(日本岛津公司)。RNA提取试剂为Trizol试剂(美国invitrogen公司)；miRNA专用反转录试剂盒及miScript反转录试剂盒(德国Qiagen公司)；其他常规试剂均为分析纯。

1.3方法

1.3.1总RNA的提取 采用液氮研磨法将组织磨成粉末，严格按照说明书的步骤加入Trizol试剂提取研磨后标本中的总RNA，使用紫外分光光度计检测其水平，记录吸光度值(A260)，所提取总RNA放置于-80 ℃冰箱保存待测。

1.3.2实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 按照miScript反转录试剂盒说明书的步骤操作。取1 μL总RNA加入20 μL反应体系中，在PRISM7000实时荧光定量PCR仪上进行反转录，将反应体系设置为37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，合成cDNA，稀释10倍后放置于—20 ℃保存待测。以U6 snRNA作为内参，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成，引物序列见表1。样品目的基因相对表达水平采用ΔΔCT方法计算，其中相对表达水平=2-ΔΔCT。

1.4观察指标 比较miR-122和miR-144-3p在癌组织与癌旁组织中的差异。 以肾细胞癌组织中miR-122、miR-144-3p的表达水平平均值作为分界，将46例患者分为miR-122低表达和miR-122高表达、miR-144-3p低表达和miR-144-3p高表达，并分析不同年龄、性别、临床病理特征患者中miR-122和miR-144-3p的表达情况。

表1 RT-qPCR特异性引物

2 结 果

2.1癌组织和癌旁组织中miR-122和miR-144-3p的表达情况 miR-122和miR-144-3p在肾细胞癌患者癌组织和癌旁组织中的相对表达水平见表2，miR-122和miR-144-3p在肾细胞癌患者癌组织中的相对表达水平均明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 miR-122和miR-144-3p表达水平比较

2.2不同特征患者 miR-122在癌组织中的表达情况 不同年龄、性别患者miR-122低表达和miR-122高表达百分率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。不同TNM分期、临床分期患者miR-122低表达和miR-122高表达百分率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同特征患者 miR-122在癌组织中的表达情况[n(%)]

2.3不同特征患者miR-144-3p在癌组织中的表达情况 不同年龄、性别患者miR-144-3p低表达和miR-144-3p高表达百分率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。不同TNM分期、临床分期患者miR-144-3p低表达和miR-144-3p高表达百分率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同特征患者miR-144-3p在癌组织中的表达情况[n(%)]

续表4 不同特征患者miR-144-3p在癌组织中的表达情况[n(%)]

3 讨 论

肾细胞癌是我国目前发病率增长最快的恶性肿瘤之一，其起病较隐匿，早期临床症状不明显，因此早期诊断困难，且患者预后不佳，存活患者生活质量差。近年来，生物标志物的研究成为热点，为了改进临床诊断策略，提高疾病的治疗效果，筛选新的肾细胞癌生物标志物作为治疗靶点引起了重视。已有研究显示，miRNAs以多种信号途径参与了肾细胞癌的调控[10-12]。有研究表明，miRNA在肾细胞癌和其他人类恶性肿瘤中起着重要作用，肾细胞癌组织中也存在miRNA表达的异常[13-14]，本研究对新的肾细胞癌标志物miR-122和miR-144-3p在肾细胞癌中的表达及临床意义进行探讨，以期为肾细胞癌的临床诊断提供新的思路和参考。

以往研究显示，尽管大部分miRNAs在肾细胞癌中表达下调[15-16]，但是还是存在一些miRNAs的表达上调，如在肾细胞癌中miR-122的表达水平明显上调[17]。作为一种特异性miRNAs，miR-122在脂肪和胆固醇代谢中发挥着重要作用。研究显示，与癌旁组织相比，肾细胞癌组织中的miR-122表达上调，并且肾细胞癌组织中的miR-122水平与预后密切相关[18-21]。miRNA参与调控细胞增殖、分化和凋亡等多种生理过程，miR-144位于染色体17q11.2，具有miR-144-3p和miR-144-5p两种形式[22]。miR-144-3p可参与多种癌细胞的增殖、分化过程，能够促进肺癌细胞、肝癌细胞和胶质瘤细胞的增殖、迁移，发挥促癌基因的作用[23-25]。邱彬[26]的研究显示，在裸鼠体内miR-144-3p能促进肾细胞癌的肿瘤形成和生长，在肾细胞癌的发病机制中起重要作用。楼宁[27]的研究也显示，miR-144-3p在肾透明细胞癌组织中的表达水平明显高于正常组织。

本研究结果显示，miR-122和miR-144-3p在肾细胞癌患者癌组织中的相对表达水平均明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。肾细胞癌组织中miR-122和miR-144-3p表达水平的高低与TNM分期、临床分期关系密切，提示miR-122和miR-144-3p可能在肾细胞癌发生、发展中起重要作用。

本研究为miR-122和miR-144-3p在肾细胞癌发生、发展中的机制研究提供了新的思路和参考，miR-122和miR-144-3p有望成为肾细胞癌早期诊断和预后判断的新标志物。