李 黎，唐李凤，钟雪梅，任 杰，张素杰，何川疆，邹小广△，许爱敏▲

1.新疆维吾尔自治区喀什地区第一人民医院呼吸与危重症医学科，新疆喀什 844000；2.石河子大学，新疆石河子 832000

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种可防、可治的常见病[1]。我国COPD的疾病负担重，患病率呈逐年上升趋势[2]。COPD病因和发病机制复杂，受环境和遗传因素共同影响[3]。目前，研究结果表明COPD的分子发病机制主要是气道炎性反应，且氧化应激可促使炎性反应相关基因表达[4]。Nrf2的激活是机体抵抗氧化应激的关键，它可调节多个抗氧化酶来保护细胞免受氧化损伤[5]。近年来研究发现，Nrf2启动子区域的多态性与COPD易感性有关，围绕Nrf2遗传变异的研究可能开辟未来治疗COPD的重要途径[6]，然而，关于Nrf2基因多态性与维吾尔族人群COPD的相关性研究报道较少。本研究旨在评估Nrf2基因位点rs35652124、rs6721961单核苷酸多态性(SNP)与维吾尔族人群COPD易感性的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年9月至2019年9月在新疆维吾尔自治区喀什地区第一人民医院接受治疗的203例COPD患者作为病例组，COPD的诊断符合《慢性阻塞性肺疾病诊断、治疗与预防全球倡议》(GOLD)标准[1]。同期选择新疆维吾尔自治区喀什地区第一人民医院199例维吾尔族体检健康者作为对照组，均满足以下条件:(1)胸部CT检查结果显示无器质性病变；(2)肺功能正常，第1秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1% Pred)>80%，吸入400 μg沙丁胺醇30 min后第1秒用力呼气容积与用力肺活量比(FEV1/FVC)>70%。所有研究对象均符合以下标准：(1)排除与氧化应激有关的疾病，如支气管扩张、肺结核、肺间质纤维化、结节病、支气管哮喘、糖尿病、心脏病等；(2)排除有各系统肿瘤病史；(3)均为维吾尔族，至少3代长期居住于喀什地区，各研究对象之间无任何血缘关系，且无外族通婚史。本研究通过新疆维吾尔自治区喀什地区第一人民医院伦理委员会审核批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1DNA提取 采集所有研究对象清晨空腹外周静脉血，使用Greiner 基因组DNA提取试剂盒(德国，Greiner)按照说明书步骤从全血标本中提取DNA。

1.2.2SNP选择 使用Sequenom公司Genotyping Tools 及MassARRAY Assay Design软件设计待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物，并送至中国上海天昊生物技术有限公司进行PCR扩增，引物序列见表1。

1.2.3基因检测 采用多重PCR技术，在以下反应条件下扩增所选位点的基因序列：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，循环40次，最后72 ℃延伸3 min；然后将扩增产物用虾碱性磷酸酶处理以除去反应中的dNTPs，再经过单碱基延伸引物(约20 bp)扩增SNP位点及树脂纯化，最后采用Sequenom-MassARRAY SNP技术进行SNP分型检测[7]。

表1 Nrf2基因多态性位点引物序列

2 结 果

2.1Hardy-Weinberg平衡检验 分别对两组研究对象中所检测到的Nrf2基因多态性位点(rs6721961、rs35652124)的基因型分布频率进行 Hardy-Weinberg平衡检验，结果显示这两个位点的基因分布均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡(P>0.05)，具有群体代表性。

2.2病例组与对照组基线资料比较 病例组与对照组在性别、BMI、吸烟、动物粉尘暴露方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。两组间年龄、SI、FEV1%Pred、用力肺活量占预计值百分比(FVC%Pred)比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3两组Nrf2基因多态位点的基因型及等位基因分布频率比较 病例组与对照组rs6721961(G/T)、rs35652124(C/T)的基因型和等位基因分布频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 两组的基线资料比较

表3 两组Nrf2基因多态位点的基因型和等位基因分布频率比较[n(%)]

基因位点nrs6721961GGGTTTGT对照组199105(52.8)86(43.2)8(4.0)296(74.4)102(25.6)病例组203124 (61.1)71(35.0)8(3.9)319(78.6)87(21.4)χ2-2.9680.104-1.971OR(95%CI)-0.699(0.465～1.051)0.847(0.307～2.334)-0.791(0.571～1.097)P-0.0850.748-0.160

2.4多因素Logistic回归分析 在校正性别、年龄、吸烟等混杂因素后，结果显示rs35652124、rs6721961位点的基因型和等位基因分布频率与COPD的关系差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 多因素Logistic回归分析

续表4 多因素Logistic回归分析

3 讨 论

氧化应激损伤和抗氧化防御机制在COPD的发生、发展中起着重要作用，Nrf2是维持肺组织增生和存活最重要的抗氧化分子之一[8]。在氧化应激状态下，位于细胞质的Nrf2分子转移至细胞核内与抗氧化反应元件(ARE)结合，促进抗氧化剂基因表达[9]，进而发挥稳定抗氧化作用。近年来研究发现，Nrf2 表达下调可能是COPD发病的重要原因之一，激活Nrf2表达可能是未来治疗COPD的重要途径[10]。

SNP是人类遗传变异最常见的来源，当关键区域突变时可能会影响基因功能。近年来，国内外已开展多项关于Nrf2启动子区域SNP与COPD易感性的研究。例如，美国学者研究发现，Nrf2启动子区域的rs6721961(C/C)与极低出生体质量(VLBW)新生儿重度支气管肺发育不良(BPD)风险降低有关[11]，而事实上幼年时期肺发育不良是COPD的重要危险因素之一[12]。此前，国内针对内蒙古地区蒙古族人群的研究发现，rs6721961位点与COPD遗传易感性不相关[13]。但周小果[14]的研究却发现，rs6721961(C/A)的A等位基因频率是我国汉族COPD的危险因素。此外，Nrf2启动子区域的rs35652124位点也显示出与氧化应激性疾病风险的相关性，俄罗斯最近的一项研究发现，rs35652124位点SNP是吸烟人群COPD的危险因素，该位点AA基因型与FEV1明显相关[15]。有趣的是，本研究证实Nrf2启动子区基因位点rs35652124(C/T)、rs6721961(G/T)SNP与COPD的关系差异无统计学意义(P>0.05)。本研究强调了不同人群COPD易感性的遗传异质性。

本研究是首次在维吾尔族人群中进行Nrf2基因多态性与COPD相关性的研究，由于样本地理来源的局限性，研究结果仅表明这两个基因位点在喀什地区维吾尔族人群中存在差异。但由于本研究样本有限，结果可能存在偏差。鉴于本研究得到的阴性结果，未来的研究将增加样本量以充分了解更多的遗传异质性。

综上所述，本研究显示Nrf2启动子区基因位点rs35652124和rs6721961SNP与维吾尔族人群COPD发病无关，表明遗传与环境等因素共同影响着COPD的发生、发展，基因多态性与疾病的相关性因地域或种族不同而存在一定差异，有待进一步深入研究。