曾 东 牛 娇 李长义 常 津 牛光良▲

1.北京市中西医结合医院口腔科，北京 100039；2.山西医科大学第二医院口腔科，山西太原 030001；3.天津医科大学口腔医院院办，天津 300070；4.天津大学生命科学学院纳米医学研究所，天津 300072

口腔临床中，无痛治疗观念的普及使局麻药的应用非常广泛，且以局部注射麻醉为主，几乎很少应用口腔表面麻醉剂。表面麻醉剂具有无痛、无损伤等优点[1]，更符合无痛治疗理念。但是，现有商品化的表面麻醉剂普遍存在起效慢、作用表浅、麻醉效果不佳等缺点[1-2]，开发渗透力强、起效快、麻醉效果好的表面麻醉剂成为倍受关注的研究方向之一[3-4]，尤其以脂质体为载体的透皮给药系统为近年来新的研究方向[2]。

本课题组与天津大学材料学院纳米生物技术研究所自主研发了新型表面麻醉剂-载盐酸利多卡因葡聚糖基纳米高分子脂质体（Lidocaine hydrochloride lysine-linoleic acid modified dextran polymeric lipid vesicles，LID-LLD-PLVs），是以赖氨酸、亚油酸、葡聚糖和胆固醇合成的葡聚糖基纳米高分子材料为载体，包载利多卡因（Lidocaine，LID）合成[5]，各项理化性能良好[5]，并具有优越的透皮性能，可有效增加利多卡因的透皮量和渗透深度[6]。为了探讨其口腔黏膜表面麻醉作用机制，本研究以家兔下颌前牙唇侧牙龈为给药部位，通过实时荧光定量PCR（real-time PCR）对牙龈、三叉神经节和延髓中P 物质（substance P，SP）、降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）和即刻早期基因（c-fos）进行了mRNA 定量分析对比。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 材料与试剂

LID-LLD-PLVs，天津大学材料学院纳米生物技术研究所实验室自制；Trizol，批号15596-026，Invitrogen生物科技公司；DEPC 处理水，批号BYL40387 上海基尔顿生物公司；异丙醇HPLC 级，上海国药集团；无水乙醇AR 级，上海国药集团；SYBRGreen PCR 试剂盒，批号F-415XL，反转录试剂盒，批号K1622，Thermo 科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

Real-time PCR 仪，ABI-7300，ABI 公司；旋涡振荡器，XW-80A，上海青浦泸西仪器厂；手握式电动匀浆机，F6-10，德国FLUKO；低温冷冻离心机，Sigma；移液器，吉尔森P 型移液器，3K15。

1.1.3 实验动物

新西兰兔24 只，健康、口颌系统无异常，8 月龄，雌雄、颜色不限，体重（2.0±0.2）kg，购于北京隆安实验动物养殖中心，生产许可证号：SCXK（京）2014-0003，动物质量合格证号：No.11401400000479。常温普通饲料饲养1 周。本实验经天津医科大学药物实验伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及给药

将24 只家兔按体重分层随机分组法分为4 组，每组6 只，为空白对照组（不给药）、LID-LLD-PLVs 30 min、60 min 和90 min 组，给药方法为下颌前牙唇侧牙龈表面涂抹LID-LLD-PLVs 0.5 mL 30、60 min和90 min。

1.2.2 样本采集

将家兔固定在手术台上，体位选取仰卧位，麻醉方式为全麻，给药途径为经耳缘静脉，麻醉剂选择20%乌拉坦，给药剂量为3 mL/kg。按“1.2.1”给药，然后同位置注射10%福尔马林溶液25 μL。1 h 后，静脉注射空气致死，取给药区牙龈，放入液氮速冻保存待测[7]。然后沿颅顶正中线做切口，长度40～50 mm，分离骨膜，暴露前囟、人字缝和矢状缝，确定开颅位置，咬骨钳去除部分颅骨，暴露给药同侧三叉神经节和延髓，取出放入液氮中速冻保存待测。每组兔子均进行样本采集[7]。

图1 延髓的取出

1.2.3 应用Real-time PCR 方法对牙龈、三叉神经节和延髓中SP、CGRP 和c-fos 进行mRNA 定量分析

1.2.3.1 总RNA 的抽提 取各组织100 mg 加入1 mL预冷Trizol；匀浆30～45 s（转速8000 r/min），后移至无RNA 酶的离心管中，室温放置5 min 后加入预冷的氯仿（200 μL 氯仿/1 mL Trizol），剧烈振荡15 s，室温放置10 min 后离心15 min（4℃，8000 r/min，12 000 g）；小心吸出上层水相500 μL 转移至无RNA 酶的离心管中，加入等体积异丙醇颠倒混匀6～8 次，-20℃冰箱放置30 min，然后离心15 min（4℃，8000 r/min，10 000 g），可见RNA 沉淀；弃上清，650 μL 75%乙醇洗涤沉淀，离心5 min（4℃，8000 r/min，离心半径10 cm），弃上清，重复洗涤1 次，弃上清，吸净残存乙醇，自然干燥5～10 min，20 μL DEPC 处理水，溶解RNA，-80℃冰箱保存待用[7]。

1.2.3.2 逆转录cDNA 将试剂盒从-80℃冰箱取出复溶，将5×逆转录buffer、dNTPs、MMLV、oligo（dT）10 000 r/min 数秒[7]。反应体系为：5×逆转录buffer 4 μL，oligo（dT）0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，逆转录酶MMLV 1 μL，DEPC 处理水10 μL，RNA 模板4 μL，总体积20 μL。反应条件：37℃1 h；95℃5min。灭活MMLV[7]。

1.2.3.3 real-time PCR 扩增 扩增体系为：SYBRGreen Mix 32.5 μL，上游引物F 0.5 μL，下游引物R 0.5 μL，ddH2O 水14.5 μL，cDNA 模板2 μL，总体积50 μL。条件：95℃10 min，95℃15 s，60℃45 s，40 循环[7]。溶解曲线：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s[7]。引物序列：SP，正向引物：5’-TGCCGCTTCATTTATGTC-3’；反向引物：5’-ACACTGTGCTTTGTTGAG-3’。CGRP，正向引物：5’-TGGGCTTCCTCAAGTTCTCC-3’；反向引物：5’-TCTGTCTCCTGCTGCTGTTC-3’。c-fos：正向引物：5’-CTGAGGATGGTGGAGTTG-3’；反向引物：5’-CACGAGAGTGAGGATGAG-3’。GAPDH，正向引物：5’-CTCCTGCGACTTCAACAGTG-3’；反向引物：5’TGAGGGCTCTTACTCCTTGG-3’。

1.3 统计学方法

采用仪器自带软件ABI Prism 7300 SDS Software分析计算SP、CGRP 和c-fos 的mRNA 绝对定量值。采用统计学软件SPSS 17.0 对数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

SPmRNA 定量统计分析结果：LID-LLD-PLVs30min组牙龈的SP mRNA 定量低于LID-LLD-PLVs 60 min，90 min 组，LID-LLD-PLVs 60 min 组低于LIDLLD-PLVs 90 min 组，各LID-LLD-PLVs 组均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；LID-LLD-PLVs 30 min、60 min 和90 min 三组延髓和三叉神经节中的SP mRNA 定量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但都低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2A。

CGRP mRNA 定量统计分析结果：LID-LLDPLVs 60 min 组牙龈的CGRP mRNA 定量低于LIDLLD-PLVs 30 min、90 min 组，LID-LLD-PLVs 30 min组低于LID-LLD-PLVs 90 min 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；LID-LLD-PLVs 90 min 组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。LID-LLD-PLVs 30 min组延髓中CGRP mRNA 定量低于LID-LLD-PLVs 60 min 和90 min 组，LID-LLD-PLVs 各组均低于对照组。LID-LLD-PLVs 60 min 组三叉神经节中CGRP mRNA 定量低于LID-LLD-PLVs 30 min 和90 min组，各LID-LLD-PLVs 组均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2B。

c-fos mRNA 定量统计分析结果：LID-LLD-PLVs 30 min 组牙龈的c-fos mRNA 定量与LID-LLD-PLVs 60 min 组和90 min 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。LID-LLD-PLVs 60 min 组延髓的c-fos mRNA 定量低于LID-LLD-PLVs 30 min 和90 min 组，LID-LLDPLVs 各组均低于对照组。LID-LLD-PLVs 60 min 和90 min 组三叉神经节中c-fos mRNA 定量低于LIDLLD-PLVs 30 min 组，各LID-LLD-PLVs 组均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2C。

图2 各组家兔牙龈、三叉神经节和延髓中SP、CGRP 和c-fos 的mRNA 定量（，n=6）

3 讨论

口颌面部疼痛的产生和传递主要由三叉神经介导。当口颌面部受到外界刺激，包括各种物理、化学刺激，伸入口颌面部组织内的初级感觉神经元的外轴突（位于三叉神经传入纤维内）将信息上传至胞体，胞体位于三叉神经节内。初级感觉神经元的中枢突与延髓内的三叉神经脊束核相连，完成外周信息向三叉神经脊束核的传导，之后继续上传，到达脑中枢，完成初级感觉信息的传导。痛觉信息的产生、传递过程非常复杂，很多物质参与其中，在信息的传递与调节过程中起着至关重要的作用，通常将这类物质叫做神经递质[7,9-10]。已有研究显示，与口颌面部疼痛相关的物质有SP、CGRP、c-fos 基因等[6-7,11-12]。SP 和CGRP 属于肽类神经递质，在口腔颌面部疼痛机制研究中涉及较多，以往的研究[13-14]多集中在牙髓炎[15]、牙周炎[16]、正畸[17]加力引致的疼痛等方面，c-fos 的研究相对较少。而关于局麻药对SP、CGRP 和c-fos 等物质表达的影响，几乎没有相关研究。

SP 是最早被研究者发现的肽类神经递质[16]，也是最早在牙髓中发现的神经肽，它在组成结构上含有11 个氨基酸。CGRP 是1983 年由Lénárd 等[18]发现的一种由37 个氨基酸组成的生物活性多肽。二者均由三叉神经节细胞合成并释放输送至延髓和牙髓、牙周组织等部位[21]。SP 通过扩张血管、产生内源性致痛物质而致痛[22]。CGRP 存在范围较广，其释放量与疼痛程度成正相关，即疼痛程度越强，它的释放量越大。CGRP对SP 有正、反双向调控作用，包括增加SP 的释放[22]和传导，降低降解速度[22]，延长衰变等调控达到加强痛觉传导的作用[7]。c-fos 基因[23-24]是一种即刻早期基因，无疼痛刺激时，c-fos 基因不表达，受到刺激后，迅速表达，所以在疼痛的早期即可在生物体内出现[25]，有部分研究者在颌面部炎性疼痛的研究中，把三叉神经脊束核的神经元内c-fos 表达水平作为判断刺激强度的指标[26]。

以往研究结果认为，在疼痛信息的产生、传递与调节过程中，因为刺激种类、部位不同，参与的神经递质及表达亦不同[7]。本研究应用福尔马林对牙龈致痛，对照组牙龈、三叉神经节和延髓内SP、c-fos、CGRP 均出现了高表达，证实了疼痛会诱发机体释放这几种神经递质。应用LID-LLD-PLVs 后再以福尔马林在牙龈致痛，牙龈、三叉神经节和延髓内SP、CGRP 和c-fos均有不同程度的表达降低，且在90 min 内作用未消失，推测LID-LLD-PLVs 对疼痛信息的传递起到了抑制作用，且作用时间＞90 min，肯定了其药效的持久性。但在不同部位的相同时间、或同一部位的不同时间mRAN 的表达影响未发现一致性规律。分析原因可能是：神经递质的合成、释放两种行为同时发生，最终的表达量取决于这两种行为相互抵消的结果。当伤害性刺激产生时，神经递质在不同部位及不同时间的表达并不一致，表现为合成速度和释放速度的不同，且不是维持在定量水平，而是处在动态变化中，最终的表达量往往是不可预测的。而且即使在同一个部位，参与疼痛传递的神经递质也不是唯一的，有部分因子已有研究证实，但是可能还包括很多未知因子，他们均可能对那些已知因子包括本研究涉及的SP、CGRP 和c-fos 的表达造成影响。另外在本实验中，家兔于全麻下完成实验，个体间麻醉深度的差异也可能影响SP、CGRP 和c-fos 的表达。所以，未来实验方向可以为进一步确定是否有起决定性作用的某一神经递质存在，并作为评价同类药物作用机制的标准。