陈 扬，陈献雄，欧阳春艳，钟永浩，刘晓宇

深圳大学过敏反应与免疫学研究所，深圳大学医学部，广东深圳 518060

尘螨是最强烈的室内过敏原之一，主要包括屋尘螨、粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)及埋内欧螨等，其螨体和排泄物均能引起Ⅰ型超敏反应，如过敏性鼻炎、过敏性哮喘及过敏性皮炎等多种变态反应性疾病[1-4]．研究表明，全球约有10%～20%的人对尘螨过敏，且50%以上的Ⅰ型超敏反应由尘螨引起，严重影响了人们的生活质量[5]．文献[6]研究显示，在过敏性患者中粉尘螨过敏原Der f 35与免疫球蛋白E的结合率高达77.5%.而中国尚未见Derf35基因克隆、表达、纯化及过敏原性鉴定的报道．本研究通过克隆、表达Derf35基因，并对得到的Der f 35重组蛋白进行纯化和反应原性鉴定，为过敏性疾病患者的特异性诊断及治疗提供基础，具有重要的临床意义.

1 实验材料及方法

1.1 实验材料

实验所用的粉尘螨由深圳大学医学院过敏与免疫研究所纯培养．感受态细胞为Rosetta(DE3)，表达载体为pET-32a． 尘螨过敏原血清取自深圳大学第三附属医院．

1.2 主要仪器设备与试剂

核酸电泳仪(Mini-PROTEAN Tetra)、纯化仪(NGC Quest 10)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增仪(CFX96 Touch)、电泳槽(Mini-PROTEAN)、高压电泳仪(Power pack)和紫外凝胶成像仪(Gel Doc XR+)均购自美国伯乐公司；全波长酶标仪(Multiskan GO)购自美国Thermo公司；恒温恒湿箱ZXMP-A1151购自上海智城分析仪器制造有限公司；尘螨核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)提取试剂盒 Trizol购自美国Invitrogen公司；质粒提取试剂盒Omega购自北京索莱宝科技有限公司；反转录试剂盒及PCR试剂盒均购自上海生工生物工程股份有限公司；Taq 酶、T4脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)酶和胶回收试剂盒均购自日本 Takara公司；Ni柱购自美国GE公司．

2 实验方法

2.1 粉尘螨总RNA的提取

取纯培养的粉尘螨用液氮浸泡，研磨后用RNA提取试剂盒Trizol提取粉尘螨总RNA．

2.2 粉尘螨重组过敏原Der f 35基因的扩增

以获得的总RNA为模板，根据反转录试剂盒合成DNA．依据已知的Derf35序列设计上游引物为5′-GGATCC ATGATCAAATTTTTGTGCAT-3′，下游引物为5′-CTCGAGTTAATCGGCGATTTCACCA-3′．然后进行PCR扩增．

2.3 构建粉尘螨重组蛋白表达质粒

将Derf35基因PCR扩增产物回收纯化，连接构建pET-32a-Derf35载体，并转化至大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)克隆菌TOP10菌株中，涂布至含50 μg/mL的氨苄霉素平板上，于37 ℃倒置培养过夜．次日挑选阳性菌落进行培养，取1 mL菌液送往上海生工生物工程股份有限公司测序．将测序正确的质粒与原核表达载体pET-32a用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，将得到的Derf35基因片段与pET-32a酶切产物连接，构建pET-32a(+)-Derf35重组质粒．将重组质粒转入感受态细胞Rosetta(DE3)中用于诱导表达．

2.4 诱导表达粉尘螨重组蛋白

少量表达粉尘螨重组蛋白的具体操作为：① 取20 μL含有Derf35的克隆菌菌液加入到20 mL的Luria-Bertani(LB)培养液(含100 μg/mL氨苄青霉素)中，于37 ℃、150 r/min的摇床中震荡培养过夜；② 取培养后的菌液1 mL加入到20 mL新灭菌的LB培养液中，再加入20 μL氨苄青霉素，于37 ℃、150 r/min的摇床中震荡培养4 h；③ 待细菌生长至对数生长期即光密度值D(600)为 0.6～0.9时，加入20 μL的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，分别于37 ℃、150 r/min条件下培养4 h，16 ℃、150 r/min条件下培养20 h，进行诱导表达；④ 收集沉淀超声破碎，取样进行聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)电泳鉴定表达情况．

大量表达粉尘螨重组蛋白的具体操作为：取50 μL含Derf35的克隆菌菌液加入到50 mL的LB培养液(含100 μg/mL氨苄青霉素)中，于37 ℃、150 r/min的摇床中培养过夜，取50 mL菌液加入到1 L的LB培养液(含100 μg/mL氨苄青霉素)中，于37 ℃、150 r/min的摇床中培养4 h后，加入IPTG高温(37 ℃)诱导4 h，离心收集沉淀．

2.5 粉尘螨重组蛋白pET-32a-Der f 35的纯化

粉尘螨重组蛋白pET-32a-Der f 35的纯化步骤为：① 将离心收集的含Derf35基因的克隆菌菌体用6 mol的盐酸胍重悬超声破碎，离心取上清液；② 用5倍体积柱平衡缓冲液(由50 mmol/L Tris、 200 mmol/L NaCl和4 mol/L尿素配制)预平衡Ni-NTA 柱，取上清液清上样；③ 上样完毕后，用10倍体积柱体积的平衡缓冲液(由50 mmol/L Tris、 200 mmol/L NaCl和4 mol/L尿素配制)洗涤； ④ 再用10倍体积柱体积的洗涤液(由50 mmol/L Tris、 150 mmol/L NaCl、 4 mol/L尿素和40 mmol/L咪唑配制)洗涤；⑤ 用洗脱液(由50 mmol/L Tris、 200 mmol/L NaCl、 4 mol/L尿素和300 mmol/L咪唑配制)将目的蛋白洗脱、收集；⑥ 将纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE 电泳分析．

2.6 免疫印迹及免疫原性分析

对纯化后的pET-32a-Der f 35重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，电转至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)上，进行免疫印迹(western blot)分析．使用含50 g/L脱脂奶粉的TBST(tris buffeered saline with Tween-20)缓冲液室温封闭2 h后，再用含25 g/L脱脂奶粉的TBST缓冲液对尘螨过敏患者的阳性血清进行稀释(体积比为10∶1)，4 ℃孵育过夜．回收血清后，用TBST缓冲洗涤3次，稀释偶联辣根过氧化物酶鼠抗人IgE作为二抗孵育1.5 h后，用TBST缓冲液洗涤3次．多功能化学发光成像仪检测粉尘螨重组蛋白pET-32a(+)-Der f 35免疫原性．

3 结果与分析

3.1 粉尘螨过敏原Der f 35基因的构建

使用限制性内切酶BamH I和XhoI对pET-32a-Derf35重组质粒进行双酶切鉴定，经质量浓度为20 g/L的琼脂糖凝胶电泳，结果如图1，在500碱基对(base pair, bp)处附近可见目的基因片段，该基因与Derf35基因片段大小相符．

1为Der f 35基因片段；M为D10000 bp DNA分子标记图1 pET-32a-Der f 35重组质粒 BamH I和Xho I双酶切鉴定Fig.1 Identification of pET-32a-Der f 35 through double enzyme digestion by BamH I and Xho I

3.2 粉尘螨重组蛋白的表达及纯化

将含有PET-32a-Derf35重组质粒的Rosetta感受态细胞置于LB培养基中培养，分别在16 ℃和37 ℃两种条件下诱导其表达目的蛋白，结果如图2．由图2(a)可见，在37 ℃时Der f 35重组蛋白诱导量较多，且为包涵体．由图2(b)可见，37 ℃诱导条件下Der f 35大量表达，纯化后可得到纯度较高的pET-32a-Der f 35重组蛋白．

M为DB170-10蛋白分子量标记；1为诱导前克隆菌菌液；2为16 ℃诱导后的上清液；3为16 ℃诱导后的沉淀；4为37 ℃诱导后的上清液；5为37 ℃诱导后的沉淀； 7为Der f 35重组蛋白图2 重组蛋白Der f 35的表达和纯化Fig.2 Expression and purification of recombinant protein Der f 35

3.3 粉尘螨重组蛋白免疫原性的鉴定

将重组蛋白pET-32a-Der f 35转移至PVDF膜上，取10份尘螨阳性患者血清进行一抗实验，结果如图3，表明重组蛋白Der f 35具有免疫原性．

3.4 粉尘螨过敏原Der f 35的系统进化树分析

将Der f 35氨基酸序列输入美国国家生物信息中心(National Coalition Building Institute, NCBI)进行Blast比对分析，并将同源序列以Fasta格式保存．使用MEGA7软件分析并构建进化树，结果如图4．由图4可见， 粉尘螨与屋尘螨、 热带无爪螨、 害嗜鳞螨、 绵羊痒螨和免耳痒螨的亲缘关系比较近．

图3 Der f 35蛋白与过敏性疾病患者的血清结合Fig.3 Binding of Der f 35 to serum from patients with allergic diseases

3.5 粉尘螨Der f 35蛋白的二级结构预测

将Der f 35的氨基酸序列输入Protean网站进行二级结构预测，结果如图5．图5显示，Derf35基因编码的氨基酸序列由2个α螺旋、6个β折叠、2个β转角和10个无规则卷曲片段组成，还含有1个潜在的T细胞抗原表位．

图4 Der f 35的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of Der f 35

图5 Der f 35蛋白的二级结构预测Fig.5 Secondary structure prediction of Der f 35 protein

4 讨论

目前，尘螨过敏疾病的临床诊断主要依赖免疫学检测，而针对尘螨过敏疾病最常用且最有效的方法是特异性免疫治疗(specific immunity，SIT)[7-9]．将微量尘螨过敏原通过舌下或口服给药途径进行脱敏治疗[10-11]，可减少过敏性休克的发生概率，再逐步增加尘螨过敏原的含量，从而达到提升尘螨过敏患者对特异性过敏原的免疫耐受能力，减轻或控制其过敏症状的治疗目的．其中，舌下给药脱敏是目前依从性最好的剂型．

但传统尘螨过敏原为天然尘螨疫苗，即尘螨粗提取液，其成分复杂，含有多种过敏原，非过敏性或毒性蛋白及杂质，且含量不稳定，组分无法标准化，导致安全性低且重复性差[12]．运用尘螨粗提取液作为尘螨疫苗不仅治疗周期长，且副作用大，长期使用易导致肿胀、红晕、坏死或硬结等局部反应，以及喉头水肿、血管性水肿、全身红斑、荨麻疹、支气管痉挛、哮喘甚至休克等全身反应[13-14]．随着尘螨相关的变态反应疾病患病率逐渐上升，临床对尘螨过敏的诊断和治疗也提出了更高的要求．因此，新型尘螨疫苗(包括DNA疫苗、重组活菌疫苗、细菌性疫苗和重组蛋白疫苗)作为替代尘螨粗提取物的脱敏治疗新方案，具有很好的应用前景，其成分清晰且作用机理明确，有利于临床进行标准化的治疗．重组蛋白疫苗是将目的抗原基因构建于表达载体上再转化至细菌、酵母、昆虫或动物细胞中，通过诱导表达大量抗原蛋白再进行纯化所制备的疫苗，具有纯度高、产量高、稳定性好，且安全性高的优点[15]．

本研究提取了粉尘螨总RNA，通过RT-PCR扩增得到Derf35基因，并将其连接至pET-32a表达载体上，然后转化到Rosetta感受态细胞中；在一定条件下诱导该基因大量表达，纯化得到大量目的蛋白，通过Western blot鉴定其免疫原性，得到尘螨Der f 35单一过敏原．有助于完善临床上过敏性疾病的特异性诊断及尘螨疫苗的制备[16]，降低尘螨粗提取液带来的风险，为临床治疗提供了基础材料，也为实现精准医疗打下基础[17]．通过构建系统进化树，可以预测对人类具有同样过敏原性的尘螨，找到亲缘关系较近的尘螨并对其蛋白质序列分析，进而找到相对保守的氨基酸序列，辅助相对广谱性的靶向药物的开发和研究．通过生物信息学方法进行分析，可预测重组蛋白Der f 35的蛋白质二级结构主要含有β折叠及无规则卷曲片段和潜在的T淋巴细胞抗原决定簇片段，为尘螨过敏性疾病的诊断提供理论依据．

结 语

通过基因工程技术成功克隆、表达和纯化出粉尘螨Derf35基因和蛋白Der f 35，且Western blot结果发现，Der f 35具有较强过敏原性，是一种新过敏原．研究结果可为尘螨过敏性疾病诊断及新型过敏原疫苗研制提供理论依据．

致谢:衷心感谢深圳大学刘志刚教授的悉心指导！