杨瑞虹，何 群，郝志英，徐变珍，李慧芳,徐 珍

(1.山西卫生健康职业学院，山西 晋中 030619;2.中南大学湘雅医学院,湖南 长沙 410078;3.山西省肿瘤医院，山西 太原 030000)

苦参碱系从中药苦参中提取分离出的生物碱，现代药理研究表明苦参碱在保护肝脏和心脑血管、抗病毒、免疫调节等方面具有重要的临床应用价值[1，2]。近年来大量的体内外研究证实，苦参碱能有效抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞分化，在抗肿瘤方面具有明显功效[2，3]。研究证实氨基甾体化合物对慢性髓性白血病K562细胞具有抑制增殖和诱导分化作用[4]。利用药物拼合原理，将苦参碱的水解产物苦参酸与氨基甾体成酯，所得产物为新化合物，目前尚未有关有该化合物的研究报道，由于合成所用的两个化合物均具有抗肿瘤活性，有望产生协同作用，提高苦参碱的抗肿瘤活性。结合苦参碱和氨基甾体化合物的抗瘤谱，选择人髓性白血病K562细胞株为体外试验细胞，K562细胞系建于CML急变期的患者，是第一个人类髓性白血病人工培养的细胞，已广泛用作研究白血病的细胞模型[3-6]。本试验旨在研究苦参酸-氨基甾体化合物(KSS-KH)对人髓性白血病K562细胞株增值及分化的影响。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

K562细胞由中南大学湘雅医学院血液生理研究室提供，RPMI1640培养基(美国GIBCO公司)，新生牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)，琼脂(美国Sigma)，MTT试剂盒(美国Sigma)，流式细胞仪(美国Beckman公司)，多功能酶标仪(美国Thermo公司)，苦参碱(KSJ 大连美仑生物技术有限公司，批号：110805-201709)，苦参酸-氨基甾体化合物(KSS-KH 课题组自制)，氨基甾体化合物(KH 中南大学湘雅医学院血液生理研究室提供)

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 K562细胞株由中南大学湘雅医学院血液生理研究室传代保存，将K562细胞加入含10%新生牛血清的RPMI1640培养基中，置于培养箱(37℃，5%CO2)中，饱和湿度培养。取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 样品溶液配制及实验分组 RPMI1640培养基用无菌双蒸水溶解，碳酸氢钠调pH值至7.2～7.4，滤过除菌备用；KH、KSS-KH、 KSJ.KH(苦参碱和氨基甾体1∶1混合物)用二甲基亚砜(DMSO)分别配置成10-1M的储备液，再用上述RPMI1640培养基分别稀释成(10-4～10-8)为三个实验组；空白对照组加入实验组等量的RPMI1640培养基。

1.2.3 样品对K562细胞液体培养的影响 取对数生长期细胞以每mL 5×104个加入培养体系，三个实验组分别加入不同浓度(10-4～10-8)的KH、KSS-KH、 KSJ.KH，空白对照组加入实验组等量的RPMI1640培养基，接种1 mL于24孔板中，每组平行接种3孔，培养5 d，用MTT计数细胞数，实验重复3次。

1.2.4 MTT比色法测定样品对细胞增殖抑制作用 采用96孔板培养K562细胞，使每mL含5×104个细胞；三个实验组分别加入不同浓度(10-4～10-8)的KH、KSS-KH、 KSJ.KH，空白对照组加入实验组等量的RPMI1640培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中，饱和湿度培养5 d，离心、吸去上清；每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h,离心、吸去上清；每孔加入100 μL DMSO，低速震荡10 min，使甲瓒结晶物充分溶解；用酶联免疫检测仪，以溶剂DMSO孔为空白，在590 nm波长下测定各孔的吸光度(OD值)，计算细胞增殖抑制率。实验重复三次。

1.2.5 瑞氏染色观察细胞形态 将105个K562细胞加入10 mL含10%新生牛血清的RPMI1640培养基中；实验组分别加入不同浓度(10-4～10-8)的KSS-KH，空白组加入实验组等量的RPMI1640培养基，置于培养箱(37℃，5%CO2)中，饱和湿度培养5 d，离心收集细胞，涂片，滴加瑞氏染液，固定细胞约1 min，再滴加等量PBS (pH值至6.4～6.8)缓冲液，使染液充分混匀，染色10 min，冲洗、凉干、镜检，观察细胞形态的变化。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 对K562细胞增殖的抑制作用 KSS-KH、KH、KSJ.KH对细胞增殖的影响见表1，剂量抑制曲线见图1。

表1 不同浓度药物对K562细胞MTT值的影响

图1 不同浓度药物对K562细胞增殖抑制的影响

2.1.1 不同浓度氨基甾体化合物(KH)对K562细胞的增殖抑制作用 不同浓度KH处理K562细胞5 d后，细胞增殖抑制率随着药物的浓度增加而升高，各浓度抑制率具有显著的差异性(P<0.05)，10-8M对K562细胞即有抑制作用，10-5M细胞增殖抑制率显著提高(22.3%)，10-4M细胞增殖抑制率达到94.1%。

2.1.2 不同浓度苦参碱和氨基甾体(1∶1)混和物(KSJ.KH)对K562细胞的增殖抑制作用 不同浓度KSJ.KH处理K562细胞5 d后，细胞增殖抑制率随着药物的浓度增加而升高，各浓度抑制率具有显著的差异性(P<0.05)，10-4M对细胞增殖抑制作用与单独使用KH接近，说明苦参碱和氨基甾体联合使用，仅具有相加作用，但不呈现协同作用。

2.1.3 不同浓度苦参酸氨基甾体化合物(KSS-KH)对K562细胞的增殖抑制作用 不同浓度KSS-KH处理K562细胞5 d后，结果显示10-8～10-6M与对照组无显著差异(P>0.05)，10-8M对K562细胞无抑制作用，10-7～10-5M细胞增殖抑制率均低于单独使用KH及苦参碱和氨基甾体混和物(KSJ.KH)，但10-4M对细胞增殖的抑制作用显著提高(98.8%)，与其他各浓度抑制率具有显著差异性(P<0.05)，说明KSS-KH在较高浓度下对K562细胞具有较强的抑制作用。

2.1.4 比较相同药物浓度下，不同实验组之间的差异 在10-8～10-5M 各实验组间对细胞的抑制率有显著差异(P<0.05)；10-4M浓度下KH和KSJ.KH之间无显著差异，但KSS-KH与KH、KSJ.KH组间有显著差异(P<0.05)，说明在较高浓度下苦参酸氨基甾体化合物(KSS-KH)对K562细胞增殖的抑制率明显强于其他两组。

2.2 瑞氏染色观察细胞形态

K562细胞经处理，采用瑞氏染色，观察细胞形态。对照组未经药物处理，K562细胞呈圆形或椭圆形，细胞核和胞浆无明显界线，细胞浆呈蓝紫色；实验组经KSS-KH(10-6M)处理后，细胞体积增大、细胞染色质变浅，细胞核浆比变小，呈现分化特征见图2。

图2 K562细胞形态对比(A.未经药物处理的细胞;B.经10-6 KSS-KH处理的细胞)

3 讨论

慢性髓性白血病(CML)又称为慢性粒细胞白血病，是造血干细胞恶性克隆性疾病，以髓系细胞恶性增殖为特点，K562细胞系研究慢性髓性白血病的细胞模型。本试验将目标化合物苦参酸-氨基甾体(KSS-KH)与氨基甾体(KH)、苦参碱氨基甾体混合物(KSJ.KH)对K562细胞抑制作用进行比较，结果发现将苦参酸-氨基甾体化合物对K562具有较强的抑制作用，说明将苦参碱水解，与氨基甾体形成酯，两种药物可能会产生协同作用；

形态学观察K562细胞经KSS-KH处理后，细胞体积变大，呈现分化特征，提示KSS-KH可能会通过诱导K562细胞分化而发挥作用，但作用机制有待进一步研究；苦参酸-氨基甾体化合物(KSS-KH)是利用苦参碱为原料进行深度开发，充分利用我国独特的中药生态资源，发挥中医药在防治疑难病症中的作用。目前慢性髓性白血病(CML)主要采用化学药物和骨髓移植治疗，骨髓移植受供体来源等限制难以广泛使用，化学药物治疗中药物对人体正常细胞会产生较大的毒性，而本课题利用苦参碱合成的新型化合物，可发挥天然产物毒性较低的优势，使其更安全有效地用于临床，具有进一步研究开发的价值。