闫茹诚，张 陈，张 泽，王 冲，刘甜甜，黄后宝

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 泌尿外科,安徽 芜湖 241001)

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率均较高[1]。膀胱癌可分为两类：非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle- invasive bladder cancer，NMIBC)、肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer，MIBC)，约有30%的NMIBC患者进展为MIBC，后者多有转移，预后差[2]。目前治疗膀胱癌的方法主要是手术结合化疗和放疗的多元化治疗手段，但是膀胱癌的发病率和病死率仍然较高。因此，充分挖掘膀胱癌的分子机制是目前膀胱癌的研究热点。

近年来，有报道称多种microRNA (miRNA)参与了人类癌症的发病过程，其中miRNA可以作为癌基因和肿瘤抑制因子发挥作用[3]。miRNA是一类由大约19～24个核苷酸组成的非编码小 RNA 分子，通过靶向下游mRNA影响其转录或翻译从而调控基因的表达[4]。已有文献报道miR-212-3p参与各类肿瘤的发生发展：miR-212-3p通过直接靶向MAP3K3抑制高级别浆液性卵巢癌进展[5]；miR-212-3p通过抑制SGK3从而调控胶质母细胞瘤细胞增殖[6]；miR-212-3p通过抑制结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)从而抑制人肝癌细胞的增殖和侵袭[7]。本研究将探讨miRNA-212-3p在膀胱癌组织及细胞中的表达情况以及其对膀胱癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。

1 材料和方法

1.1 细胞系及细胞培养 人正常尿路上皮细胞SV-HUC-1及人膀胱癌细胞株T24和EJ均来自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。SV-HUC-1在F-12K培养基(Gibco,美国)中培养，膀胱癌细胞株在RPMI-1640培养基(Gibco,美国)中培养，所有培养基均添加10%胎牛血清(Gibco，美国)，所有细胞均在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

1.2 组织标本 收集弋矶山医院泌尿外科30对新鲜膀胱癌组织及相邻正常组织，所有组织均来源于膀胱癌根治术后标本，相邻正常组织为距肉眼可见的癌肿5 cm以外的组织。立即用液氮冷冻至RNA提取。所有患者均签署知情同意书，男18例，女12例，平均年龄(55.0±3.4)岁。所有组织标本均储存于弋矶山医院中心实验室-80℃冰箱及液氮中。本研究经医院伦理委员会批准。

1.3 实时荧光定量PCR(qPCR) 使用TRIzol试剂(Invitrogen)从组织或培养细胞中提取总RNA。用qPCR检测miR-212-3p的表达水平,所使用的 miRNA逆转录试剂盒及SYBR试剂盒均购于广东锐博有限公司，内参引物使用U6。

1.4 细胞转染 人miR-212-3p模拟物(miR-212-3p mimic)和阴性对照模拟物(miR-212-3p mimic NC)均购于广东锐博有限公司。提前1天将T24和EJ细胞接种到6孔板中，根据制造商的说明书使用Lipofectamine 2000(赛默飞，美国)进行瞬时转染。

1.5 细胞增殖实验 采用CCK8试剂盒(上海yeason生物有限公司，中国)检测细胞增殖情况。将已经转染的细胞以2 000个细胞/孔的密度接种到96孔板中，培养3 d。每孔细胞加入10 μL的CCK8试剂，重新放回细胞培养箱避光孵育1.5 h后,酶标仪检测450 nm波长下的吸光度值(OD)。

1.6 细胞划痕实验 将转染miR-212-3p mimic及miR-212-3p mimic NC的T24和EJ细胞消化并铺板于6孔板，待细胞融合率达90%左右时，用1 000 μL的枪头垂直划竖线，然后用PBS轻轻冲洗2～3次，去除脱落的细胞，继续加入培养基进行培养，分

别在0 h和24 h拍照。

1.7 Transwell小室侵袭实验 将转染的T24和EJ细胞消化，用无血清培养基重悬后铺在包裹有基质胶的 Transwell小室(康宁公司，美国)，小室下层加入600 μL的含20%FBS的培养基，培养24 h后取出小室，倒出培养基，使用多聚甲醛固定约20 min，去除多聚甲醛后再用0.1%结晶紫染色30 min，之后在200倍倒置显微镜下拍照。

2 结果

2.1 miR-212-3p在膀胱癌组织及细胞中表达水平低 研究发现miR-212-3p在膀胱癌组织中的表达水平较邻近正常组织低，差异有统计学意义(t=3.20，P<0.01)，见图1A。miR-212-3p在T24细胞与EJ细胞较正常尿路上皮细胞的表达水平低，差异有统计学意义(F=163.60，P<0.01)，见图1B。提示miR-212-3p在膀胱癌中可能起到了抑癌作用。

A.qPCR比较膀胱癌组织与癌旁组织的miR-212-3p表达水平(**P<0.01);B.qPCR比较膀胱癌细胞与正常尿路上皮细胞的miR-212-3p表达水平(**P<0.01)。

2.2 miR-212-3p抑制膀胱癌细胞增殖 通过平板克隆实验发现，与转染miR-212-3p mimic NC相比，转染miR-212-3p mimic组的T24细胞克隆数更少，差异有统计学意义(t=21.80，P<0.01),与转染miR-212-3p mimic NC相比，转染miR-212-3p mimic组的EJ细胞克隆数更少，差异有统计学意义(t=10.01，P<0.01)，见图2A、2B；通过CCK8法发现转染miR-212-3p mimic组的T24细胞增殖能力弱于miR-212-3p mimic NC组，差异有统计学意义(t=9.19，P<0.01),转染miR-212-3p mimic组的EJ细胞增殖能力弱于miR-212-3p mimic NC组，差异有统计学意义(t=7.13，P<0.01)，见图2C。

A.平板克隆实验比较过表达miR-212-3p组与对照组的细胞增殖能力；B.采用t检验比较两组细胞克隆数目(**P<0.01)；C.CCK8法比较过表达miR-212-3p组与对照组的生长曲线及细胞增殖能力(**P<0.01)。

2.3 miR-212-3p抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭 通过划痕实验及Transwell小室侵袭实验发现，转染miR-212-3p mimic组的T24细胞24 h后细胞迁移的距离相比转染miR-212-3p mimic NC组较短，差异有统计学意义(t=9.39，P<0.01)，转染miR-212-3p mimic组的EJ细胞24 h后细胞迁移的距离相比转染miR-212-3p mimic NC组较短，差异有统计学意义(t=10.21，P<0.01)，见图3A、3B；转染miR-212-3p mimic组的T24细胞24 h后细胞侵袭的数目相比转染miR-212-3p mimic NC组较少，差异有统计学意义(t=19.42，P<0.01)，转染miR-212-3p mimic组的EJ细胞24 h后细胞侵袭的数目相比转染miR-212-3p mimic NC组较少，差异有统计学意义(t=12.08，P<0.01)，见图3C、3D。以上结果表明miR-212-3p可以起到抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭的能力。

A.划痕实验比较过表达miR-212-3p组与对照组的细胞迁移能力；B.采用t检验比较两组迁移距离(**P<0.01)；C.Transwell小室侵袭实验比较过表达miR-212-3p组与对照组的细胞侵袭能力(200×)；D.采用t检验比较两组侵袭细胞数目(**P<0.01)。

3 讨论

膀胱癌目前仍是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，术后易复发，预后差，因此积极寻找新的肿瘤标志物及新的治疗靶点是提高膀胱癌患者的生存率，预防局部复发和远处转移，改善膀胱癌患者预后的关键[8]。多项研究表明，miRNA可作为膀胱癌的诊断或治疗靶点：Li等发现CircHIPK3可以通过抑制miR-558从而调控膀胱癌细胞中的乙酰肝素酶表达[9]；Li等报道了miR-21在膀胱癌患者的组织、血浆和尿外泌体中同时上调[10];Feng等发现miRNA-556-3p通过负调控DAB2IP表达促进人膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭[11]。miR-212-3p在多种肿瘤中作为抑癌因子被报道：CD80基因中miR-132-3p、miR-212-3p和miR-361-5p结合位点的功能性变异改变了中国汉族人群对胃癌的易感性[12]；LncRNA TUG1通过调控miR-212-3p/FOXA1轴影响骨肉瘤的发生发展[13]；在胰腺癌细胞IFN-γ通过抑制miR-212-3p从而上调 RFXAP水平[14]；巨孢霉素C通过激活miR-212-3p/Sox6通路抑制胃癌的增殖和侵袭。

越来越多的研究表明，miRNAs在调节其靶基因mRNA方面发挥着至关重要的作用[15]。一个miRNA可有多个靶基因与之结合[16]，miR-212-3p目前有多个已被报道的靶基因，如SGK3[17]、SOX5[18]、HMGB1[19]等，而SOX5作为癌基因在膀胱癌中被报道[20]，但均没有解释与miR-212-3p之间的关系，这些基因可作为miR-212-3p下游靶点进行进一步探究。因此，本文与之前多项研究的报道结果一致，miR-212-3p在膀胱癌中同样下调并发挥抑癌基因的作用。首先本研究采用 qPCR 法检测膀胱癌组织和邻近癌组织中miR-212-3p的表达水平，结果发现，膀胱癌组织miR-212-3p表达水平相对较低，在细胞水平层面上也发现了同样的结果，相较于SV-HUC-1，T24和EJ细胞中miR-212-3p表达水平相对较低，这表明miR-212-3p在膀胱癌中低表达，可能起到抑制肿瘤生长的作用。与此同时采用平板克隆实验及CKK8实验发现当过表达miR-212-3p后，T24和EJ细胞的增殖能力明显减弱。为了进一步探明miR-212-3p对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响，本研究采用了划痕实验和Transwell实验，结果发现，当过表达miR-212-3p后，T24和EJ细胞迁移的距离相较于对照组较短，穿过小室细胞的数目相较于对照组较少。这些结果表明miR-212-3p可以抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭。

miR-212-3p已被证实在多种肿瘤中发挥作用，但miR-212-3p在膀胱癌发生发展中的潜在分子机制仍有待阐明。本研究发现miR-212-3p在膀胱癌组织和细胞系中表达水平低，证实了miR-212-3p对膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭发挥调控作用。这些结果为miR-212-3p调控膀胱癌发生发展的分子机制提供了新的研究路线，miR-212-3p有机会成为膀胱癌的潜在肿瘤标志物或新兴的治疗靶点。

综上所述，本研究结果显示，miR-212-3p可以抑制膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭，但没有对其靶基因进行进一步的机制研究及进行动物模型验证是本研究的局限性。本研究可能有助于深入了解miR-212-3p在人膀胱癌中发挥的作用，未来miR-212-3p在膀胱癌中是否能作为治疗靶点值得进一步研究。