朱 静，张双双，张芯悦，李光建，查盈盈，汪萌芽

(皖南医学院 1.细胞电生理研究室；2.启明星小组，安徽 芜湖 241002)

睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)是指因外界环境或自身的原因缺失了机体所需要的睡眠量的过程和状态[1-2]。持续的SD会对机体组织造成严重的损伤，如神经系统功能紊乱、免疫防御功能下降、心脏疾病等，严重者甚至可引起死亡，直接威胁到人们的生命健康[3]。近年来的研究显示，SD后导致的自由基产生增多、细胞抗氧化能力下降以及内质网应激这3条途径所导致的氧化应激是SD后诱发机体损伤的关键环节[4-5]。缺乏高质量的睡眠会影响大脑实质中神经毒性代谢物的清除，增加氧化应激，此外也有研究表明睡眠不足会降低某些抗氧化酶的表达[6]，增加体内脂质过氧化物丙二醇(malonaldehyde,MDA)的产生,对机体造成损伤[7]。研究已知，细胞抵抗氧化损伤的机制之一是通过增加抗氧化反应原件ARE基因的转录，而转录因子核因子Nrf2可以通过与ARE结合发挥作用[8-10]。二烯丙基硫醚(diallyl sulfide,DAS)是草本植物大蒜中提取的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗血小板聚集、清除自由基、降血脂及预防心血管疾病等作用[11]。DAS的脑保护机制可能与其增强大鼠脑组织抗氧化酶活性，激活细胞内氧化应激通路相关[11]。

因此DAS可能会通过降低氧化应激水平对SD引起的脑损伤有保护作用，本实验则运用DAS提前干预SD模型大鼠，观察其对SD大鼠认知功能的影响及相应机制的研究。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF级别(230±10)g成年雄性SD大鼠40只，由南京青龙山动物繁殖场提供，许可证号 SCXK (苏)2017-0001，动物实验操作均遵照中华人民共和国国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》进行。

1.2 仪器和药品 50 cm×45 cm×45 cm旷场箱(Panlab，USA)、光辐射热测痛仪(ZH-YLS-12A,安徽正华生物仪器设备有限公司)，高速离心机(北京博劢行仪器有限公司)，酶标仪(美国BioTek公司，型号EPOCH2)，DAS(合肥拜尔迪化学科技有限公司，批号：E1624032)，BCA蛋白浓度测定、脂质氧化(MDA)检测(上海碧云天生物技术有限公司)，生理盐水(批号：国药准字H34023608)，乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司，批号：20161208)，75%浓度医用酒精等。

1.3 实验方法

1.3.1 药物干预 于造模4 d前开始预防性干预

治疗，DAS组及DAS+SD组大鼠每天进行固定时间腹腔注射给药DAS(200 mg/kg，溶解于二甲基亚砜)，共给药7 d，另两组大鼠腹腔注射相同剂量二甲基亚砜对照。

1.3.2 造模 采用改良多平台法(modified multiple platform method,MMPM)[12]建立大鼠SD模型。把SD大鼠放到小平台上，大鼠进入睡眠后，由于肌张力降低而接触水或掉到水中，突然惊醒而致SD；在水箱中装入干净的清水，使水面低于平台约 1 cm，箱顶盖上大小合适的鼠笼盖，放置饲料和水瓶，大鼠均可在平台间自由活动，随意进食饮水。实验连续SD 3 d，期间对大鼠一般情况、体质量进行监测并对动物的毛皮整洁度、光亮度、饮食、体质量、精神状态、攻击行为等状态进行观测。

1.3.3 旷场实验 SD后立即进行旷场试验[13]，分析大鼠的水平穿格次数及中央区停留时间，实验时分别将每只大鼠放入大小为50 cm×45 cm×45 cm的旷场箱中心，持续记录5 min，然后取出大鼠，在放入下组大鼠前将箱底及四壁清理干净，并用75%浓度的酒精去除其残留的气味，实验期间保持安静，各组大鼠交替测试。

1.3.4 光辐射热痛甩尾潜伏期检测 用光辐射热测痛仪，对大鼠进行不同光照强度下甩尾反应潜伏期(tail flick latency，TFL)的移位法测定[14]，即首次在距鼠尾根部1 cm处，随后每隔0.5 cm依次后移光照位点，进行5个光照强度的检测，设定光辐射热测痛仪的光照强度(Focus值)为23、31、39、49、61，随后依次测定各大鼠在不同光强下的TFL。将4组大鼠的TFL随光刺激强度增强而缩短的结果采用数学模型拟合成曲线，即为甩尾反应的时反应量-效关系(timed dose-response relationship，TDRR)。

1.3.5 氧化应激指标生化检测[13]实验结束后，每只鼠根据体质量腹腔注射20%浓度的乌拉坦(7.5 ml/kg)将其麻醉，用生理盐水灌流，取下大鼠脑部，在冰上剥离出海马，冰浴研磨匀浆、离心取上清，采用丙二醛检测试剂盒(TBA比色法)及酶标比色法测定出样品吸光度(optical density，OD)，计算出各组海马MDA含量。

2 结果

2.1 旷场实验 各组大鼠的轨迹示意图以及旷场穿格次数与中央区停留时间进行组间对比如图1，单因素分析显示SD组的旷场穿格次数及中央区停留时间[(58.67±17.81)次,(1.34±1.08)min]多于Control组[(43.60±8.87)次,(0.37±0.45)min](P<0.05)；而DAS+SD组各项指标[(37.25±18.093)次,(0.33±0.21)min](P<0.05)显著下降。

Control组与SD组比较：*P<0.05;DAS+SD组与SD组比较：#P<0.05;穿格次数:F组间=5.348,P组间<0.01;中央格停留时间:F组间=5.712,P组间<0.01。

2.2 光辐射热痛实验 4组大鼠的TFL均呈现随光刺激强度增强而缩短的时反应量-效关系(P<0.05)，其中SD组大鼠的TDRR曲线较Control组左移(P<0.05)，DAS+SD组较SD组右移(P<0.05)。并在光强度23、31、61时SD组的TFL较Control组缩短(P<0.05)，DAS+SD组较SD组延长(P<0.05)，如图2。

采用双曲线TDRR模型Y=cs+1/(x-a)s+b进行曲线拟合，显示4组大鼠光强与甩尾反射潜伏期的关系。Control组,n=10;SD组,n=8;DAS组,n=9;DAS + SD组,n=9;双因素方差分析(重复测量):P<0.05,各组大鼠甩尾潜伏期随光照强度的变化；*P<0.01(SD组与Control组比较),#P<0.01(SD组与DAS+SD组比较)；F光强度=1936.169,P光强度<0.01；F光强度×组间=2.257,P光强度×组间<0.05；F组间=4.852,P组间<0.01。

2.3 氧化应激指标生化检测 海马区MDA含量检测显示如图3，SD组大鼠MDA含量[(23.57±5.68)μmol/mg]较Control组[(18.99±2.72)μmol/mg]增加(P<0.05)，DAS+SD组[(18.04±5.53)μmol/mg]较SD组减少(P<0.05)。

SD组与Control组比较：*P<0.05;DAS+SD组与SD组比较：#P<0.05;F组间=3.586,P组间<0.05。

3 讨论

本实验过程中观察到SD组大鼠活动性明显提高，出现易激惹、攻击行为，最后呈现出精神萎靡等一般情况。通过自发探索性实验发现，SD组大鼠穿格次数与中央格停留时间较Control组显著增加，表现为SD组大鼠异常兴奋性与探索性行为增强，与其他学者研究相一致[15]，而DAS+SD组指标有所下降，表现为DAS用药干预SD使大鼠异常兴奋性降低。通过痛觉检测实验，SD组大鼠热辐射痛TFL较Control组显著下降，表现为睡眠不足导致大鼠痛觉过敏，与其他研究结论相一致[16]，DAS+SD组大鼠的热辐射痛TFL较SD组升高，与Control组相似，表现为DAS干预可一定程度上改善SD大鼠的痛觉敏化。通过检测大鼠自发探索性及痛觉变化等与认知相关的实验，显示DAS干预对SD大鼠认知功能损害有改善作用。

SD组大鼠海马区MDA含量较其他各组增多，提示SD大鼠海马区产生了一定程度的氧化应激，与其他研究相一致[17]，与此同时，本实验结果DAS+SD组MDA含量较SD组减少，提示DAS干预对SD大鼠海马区氧化应激损伤有缓解作用。综合以上，DAS干预可降低SD大鼠氧化应激水平。

综合所述，本实验通过DAS预先干预SD大鼠并结合一系列认知相关实验及机制的研究，表明了DAS可能通过降低氧化应激水平从而改善SD产生的认知功能损害。但是目前对DAS的作用机制研究的并不是很清楚，本实验仅初步对DAS有一定的探索和发现，但仍未从药物作用的分子机制及其内在信号转导方面展开进一步的探索，且相关实验中提示DAS可能的作用通路Nrf2/NQO1通路[12]，是细胞内氧化应激的主要通路，可用于后期进行进一步的研究和探讨。