马晓颖，吕立涛，杨 涛，姚 澜，李长田，肖 军**

（1.辽宁省农业科学院食用菌研究所辽宁省食用菌优质栽培重点实验室，辽宁 沈阳 110161；2.吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，吉林 长春 130118）

先天免疫是指机体先天具有的正常的生理防御功能，对各种不同的病原微生物和异物的入侵都能作出相应的免疫应答，在引发炎症反应和宿主防御反应中至关重要。研究表明，巨噬细胞是免疫系统的重要成员，其不仅是局部炎症最典型的启动者，也是组织微环境的主要成分产生者，在抵御病原微生物入侵方面发挥着关键作用[1-3]。巨噬细胞已成为治疗炎症性和感染性疾病的重要靶点，目前一些化学合成的化合物已经被用作免疫调节剂来调节免疫系统的巨噬细胞功能，然而，一些不良反应，如肝毒性、肾毒性和超敏反应，限制了其临床应用[4]。因此迫切需要开发无毒、免疫活性强的天然免疫调节剂。

大型真菌在自然界分布广泛，有些可食用，有些还具有重要的药用价值[5-6]。桑黄（Sanghuangporus Sheng H.Wu，L.W.Zhou&Y.C.Dai）子实体在东亚地区被用作传统药材，其具有多种生物学功能，如抑制肿瘤生长和转移[7-8]，多年来一直受到人们的极大关注[9-10]，桑黄水提取物能够增强小鼠免疫力的免疫调节活性[11]，还可以诱导细胞凋亡[12]以及分泌细胞因子来参与巨噬细胞的反应[13]。鲍姆纤孔菌（Sanghuangporus baumii）是广义桑黄的一个品种，其子实体黄褐色，无柄、木栓质，菌盖呈马蹄形[14]。目前人工栽培鲍姆纤孔菌获得子实体的难度较大，而菌丝发酵是一种可产生大量菌丝体的人工培养方法，其发酵产物与子实体功效接近。研究其液体发酵菌丝中三萜的相关药理活性，为其产业化和应用方向提供理论依据。

通过利用不同浓度的鲍姆纤孔菌菌丝三萜对小鼠巨噬细胞RAW264.7进行建模，在脂多糖（lipopolysaccharide） 与三萜共培养的模型下，体外处理小鼠巨噬细胞RAW264.7，测定其对巨噬细胞细胞活力以及分泌一氧化氮和免疫因子的影响。为鲍姆纤孔菌的进一步开发利用奠定基础，也为免疫调节剂的研发提供一个新的方向。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鲍姆纤孔菌菌种，辽宁省农业科学院食用菌研究所育种研究室；小鼠腹腔巨噬细胞（RAW264.7），吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心实验室；DMEM高糖培养基、PBS磷酸盐缓冲液、胎牛血清，美国Gibco公司；脂多糖（LPS）、地塞米松（DXMS），美国Sigma公司；cck-8(Cell Counting Kit-8细胞计数试剂)，美国MP Biomedicals生物医药公司；一氧化氮检测试剂盒，酶联免疫试剂有限公司；细胞因子ELISA试剂盒，酶联免疫试剂有限公司。

主要仪器设备有超净工作台，苏州智净净化设备有限公司；Cytoperm2型二氧化碳培养箱，美国Thermo公司；数显恒温水浴锅，常州市江南实验仪器厂；低速离心机，美国BECMAN公司；多功能酶标仪，美国Biotek公司；倒置显微镜，日本Nikon公司；微型旋涡混合仪，上海沪西分析仪器厂。

1.2 样品的制备

1.2.1 鲍姆纤孔菌培养

将实验室保藏的鲍姆纤孔菌菌株活化接种于马铃薯液体培养基中，25℃、180 r·min-1摇床培养7 d。

1.2.2 鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜的获得

将发酵后的菌丝体用无菌水冲洗3次，放入烘箱60℃烘干，称取1 g放入50 mL离心管中，加入30 mL无水乙醇，用匀浆机打匀，超声提取30 min，用滤纸过滤2次。加入同体积的乙酸乙酯，萃取3次。取乙酸乙酯层浓缩干燥成粉末，获得总三萜，避光4℃低温保存。

1.3 试验分组

巨噬细胞培养至对数生长期后按以下处理分组：空白组（CK）、LPS模型组为添加0.1 μg·mL-1的脂多糖；药物对照组（DXMS） 为添加50 μg·mL-1的地塞米松；试验组为使用脂多糖与不同浓度的三萜（25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1和800 μg·mL-1）处理，分别编号为SGC25、SGC50、SGC100、SGC200、SGC400、SGC800。

1.4 试验方法

1.4.1 巨噬细胞的培养

将小鼠巨噬细胞（RAW264.7） 接种于50 mL培养瓶中，加入含10% PBS、1%青霉素和链霉素的DMEM培养液中，在37°C、CO2浓度5%的培养箱中培养。细胞呈单层贴壁生长，待细胞贴壁生长达80%时传代一次。

1.4.2 巨噬细胞的传代

待小鼠巨噬细胞（RAW264.7）长到培养瓶底部80%左右时，将培养瓶中培养液倒弃，瓶底细胞用胰酶消化后，用PBS进行冲洗，离心管中低速离心5 min，弃上清液，加入新鲜的培养液，在37°C、CO2浓度5%的培养箱中培养。

1.4.3 CCK-8法检测鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对巨噬细胞生长的影响

全部试验用细胞均使用进入指数生长期的细胞。取对数生长期的巨噬细胞 RAW264.7，按1×104个/孔的浓度接种于96孔板，每孔加100 μL细胞悬液，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养，空白组加入100 μL的完全培养液，LPS模型组加入培养液和脂多糖 (0.1 μg·mL-1) 各 100 μL，试验组分别加入培养液和浓度为 20 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1和 800 μg·mL-1的三萜溶液各100 μL，每组设3个重复。培养箱内培养 24 h后，每孔加入细胞培养液体积 1/10的CCK-8，2 h后在450 nm处测定OD值。细胞存活率（H，%） 的计算公式为：

式中：SOD为试验组OD值；COD为空白组OD值。

1.4.4 不同浓度鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对LPS诱导下巨噬细胞释放一氧化氮的影响

取对数生长期的巨噬细胞RAW264.7，按1×105个/孔的浓度接种于12孔板中，按照1.3步骤分组，每孔加1 mL处于对数生长期的巨噬细胞，药物干预之后，在培养箱内培养24 h后无菌收集上清液，按照ELISA检测试剂盒说明书的方法，检测培养上清中的一氧化氮的含量。

1.4.5 鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对脂多糖诱导巨噬细胞IL-1α、TNF-α、IL-6分泌量的影响

IL-1α是活化巨噬细胞分泌的重要细胞因子，低浓度时可以对机体产生调节作用，高浓度持续时对引发炎症反应[19]。IL-6是一种多功能细胞因子，能够刺激活化B细胞增殖，分泌抗体，参与炎症反应，还能有效地促进TNF和IL-1诱导的恶性病变[20]。TNF-α是一种肿瘤坏死因子，可以直接杀伤肿瘤细胞，并且能够刺激一系列免疫调节介质和炎症介质的表达[21]。

INF-r干扰素是一种糖蛋白，具有抗病毒、抑制细胞增殖、调节免疫及抗肿瘤作用[22]。但有研究表明干扰素是免疫系统中的双刃剑，既可以抑制病毒复制，又可以参与病毒的复制[23]。

取对数生长期的巨噬细胞RAW264.7，按1×105个/孔的浓度接种于12孔板中，按照1.3步骤分组；每孔加1 mL巨噬细胞，按照炎症模型药物干预后，在培养箱内培养24 h后无菌条件收集上清液；按照ELISA检测试剂盒说明书的方法，检测培养上清中各细胞因子的含量。

2 结果分析

2.1 不同浓度菌丝三萜对巨噬细胞生长的影响

不同处理下的巨噬细胞RAW264.7的细胞形态变化见图1，不同浓度的鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞生长的影响见图2。

图1 不同处理下的巨噬细胞RAW264.7的细胞形态变化Fig.1 The morphological changes of macrophages RAW264.7 with different treatments

图2 不同浓度的鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞生长的影响Fig.2 The effect of mycelium triterpenes extraction from fevmentation of Sanghuangporus baumii on the growth of mice macrophages RAW264.7 cells

由如图1可知，CK组的巨噬细胞呈圆形，细胞与细胞间会连接在一起；LPS模型组的细胞呈现较为明显的梭型状态，细胞发生极化；而SGC200组的细胞，梭型数量明显少于LPS模型组，表明菌丝三萜可以减少LPS处理后的巨噬细胞的极化状态。由图 2 可知，25 μg·mL-1～800 μg·mL-1鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对巨噬细胞无明显的毒副作用。在药物浓度达到100 μg·mL-1时，巨噬细胞的数量增加了18.22%。当药物浓度大于100 μg·mL-1时，细胞存活率呈下降趋势，说明鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对巨噬细胞生长作用存在最适浓度。

2.2 不同浓度三萜对巨噬细胞产一氧化氮的影响

一氧化氮是一种重要的生理活性分子，能够调控细胞内信号转导、细胞因子分泌和淋巴细胞分化等，可以发挥细胞自我保护作用抵抗微生物感染和抑制肿瘤生长[18]。将试剂盒中的标准品稀释至48 μmol·L-1、24 μmol·L-1、12 μmol·L-1、6 μmol·L-1、3 μmol·L-1，按照说明书配制，试验操作方法与样品组一样参见说明书。一氧化氮含量的标准曲线见图3，鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对巨噬细胞中一氧化氮含量的影响见图4。

图3 一氧化氮含量的标准曲线Fig.3 The standard curve of nitric oxide content

图4 鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对巨噬细胞中一氧化氮含量的影响Fig.4 The effect of mycelium triterpenes extraction from fevmentation of Sanghuangporus baumii on nitric oxide content in macrophages

由图3、图4可知，当菌丝三萜的浓度为200 μg·mL-1时，巨噬细胞分泌一氧化氮含量最低；当菌丝三萜浓度达到800 μg·mL-1时一氧化氮活性最高。但是所有鲍姆纤孔菌发酵菌丝试验组分泌一氧化氮含量均低于药物对照组。菌丝三萜的质量浓度为400 μg·mL-1和 800 μg·mL-1时，一氧化氮含量高于LPS模型组4.8%和8.6%。试验表明，高浓度的鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对巨噬细胞分泌一氧化氮的含量具有促进作用。

2.3 不同浓度菌丝三萜对巨噬细胞分泌IL-1α、IL-6、TNF-α和INF-r的影响

鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对小鼠巨噬细胞分泌细胞因子的影响见表1。

由表1可知，当巨噬细胞被脂多糖诱导后，其产生细胞因子的含量较空白组上升，但是加入DXMS后，各促炎因子的分泌有所下降，这表明激素类物质可以降低促炎因子的分泌量。且不同浓度的菌丝三萜处理组也会降低巨噬细胞中细胞因子的产生，从而减缓炎症的发展，且不同细胞因子存在不同最佳处理浓度，25 μg·mL-1和 200 μg·mL-1的菌丝三萜处理浓度表现最好。

表1 鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对小鼠巨噬细胞分泌各细胞因子的影响Tab.1 The effect of mycelium triterpenes extraction from fevmentation of Sanghuangporus baumii on the secretion of cytokines by mouse macrophages

2.3.1 菌丝三萜对巨噬细胞分泌IL-1α的影响

白介素IL-1α含量的标准曲线见图5，鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对巨噬细中白介素IL-1α含量的影响见图6。

图5 白介素IL-1α含量的标准曲线Fig.5 The Standard curve of IL-α content

图6 鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对巨噬细中白介素IL-1α含量的影响Fig.6 The effect of mycelium triterpenes extraction from fevmentation of Sanghuangporus baumii on interleukin IL-1α in macrophages

由图5、图6可知，以不同的对照组来看，经过脂多糖诱导的LPS模型组，其IL-1α的分泌量比空白组有所上升，与药物对照组相比也有所上升。当菌丝三萜刺激巨噬细胞后，25 μg·mL-1～800 μg·mL-1浓度范围的试验组与LPS模型组相比，除了菌丝三萜浓度为800 μg·mL-1的处理组外，其他试验组均能够显著抑制脂多糖诱导下的巨噬细胞释放IL-1α （P＜0.05）；浓度为 25 μg·mL-1和 200 μg·mL-1的菌丝三萜试验组对巨噬细胞释放IL-1α抑制性最强，抑制率达到19.3%。与药物对照组持平。由上述数据可知，菌丝三萜能够抑制脂多糖诱导下的巨噬细胞分泌 IL-1α，浓度为 25 μg·mL-1和 200 μg·mL-1的菌丝三萜抑制效果最好。

2.3.2 菌丝三萜对巨噬细胞分泌IL-6的影响

白介素IL-6含量的标准曲线见图7，鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对巨噬细胞中白介素IL-6含量的影响见图8。

图7 白介素IL-6含量的标准曲线Fig.7 The standard curve of IL-6 content

图8 鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对巨噬细胞中白介素IL-6含量的影响Fig.8 The effect of mycelium triterpenes extraction from fevmentation of Sanghuangporus baumii on interleukin IL-6 content in macrophages

由图7、图8可知 ，以不同的对照组来看，经过脂多糖诱导的模型组，其分泌IL-6的量比空白组有所上升，与药物对照组相比也有所上升。当菌丝三萜刺激巨噬细胞后，25 μg·mL-1～800 μg·mL-1浓度范围的试验组与LPS模型组相比，除了菌丝三萜浓度为800 μg·mL-1处理组外，其他试验组均能够显著的抑制脂多糖诱导下的巨噬细胞释放IL-6(P＜0.05)；浓度200 μg·mL-1的试验组对巨噬细胞释放IL-6抑制性最强，抑制率达到35%。与药物对照组持平。由上述数据可知，菌丝三萜能够抑制脂多糖诱导下的巨噬细胞分泌IL-6，浓度200 μg·mL-1的菌丝三萜抑制效果最好。

2.3.3 菌丝三萜对巨噬细胞分泌TNF-α的影响

肿瘤坏死因子TNF-α含量的标准曲线见图9，鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对巨噬胞中肿瘤坏死因子TNF-α含量的影响见图10。

图9 肿瘤坏死因子TNF-α含量的标准曲线Fig.9 The standard curve of TNF-α content

图10 鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对巨噬胞中肿瘤坏死因子TNF-α含量的影响Fig.10 The effect of mycelium triterpenes extraction from fevmentation of Sanghuangporus baumii on the content of tumor necrosis factor TNF-α in macrophages

由图9、图10可知，以不同的对照组来看，经过脂多糖诱导的LPS模型组，其分泌TNF-α的值比空白组有所上升，与药物对照组相比也有所上升。菌丝三萜刺激巨噬细胞后，25 μg·mL-1～800 μg·mL-1浓度范围的试验组与LPS模型组相比，菌丝三萜浓度为 200 μg·mL-1和 400 μg·mL-1的处理组能够显著的抑制脂多糖诱导下的巨噬细胞释放TNF-α(P＜0.05)；浓度200 μg·mL-1的试验组对巨噬细胞释放TNF-α抑制性最强，抑制率达到22%。由上述数据可知，菌丝三萜能够抑制脂多糖诱导下的巨噬细胞分泌TNF-α，浓度为200 μg·mL-1的菌丝三萜抑制效果最好。

2.3.4 菌丝三萜对巨噬细胞分泌INF-r的影响

干扰素INF-r含量的标准曲线见图11，鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对巨噬细胞中干素INF-r含量的影响见图12。

由图11、图12可知，以不同的对照组来看，经过脂多糖诱导的LPS模型组，其分泌INF-r的量比空白组有所上升，比药物对照组也有所上升。当脂多糖刺激巨噬细胞后，25 μg·mL-1～800 μg·mL-1浓度范围的试验组与LPS模型组相比，除了浓度为50 μg·mL-1和 800 μg·mL-1外，其他处理组能够显著的抑制LPS诱导下的巨噬细胞释放INF-r(P＜0.05)；浓度25 μg·mL-1的试验组对巨噬细胞释放INF-r抑制性最强，抑制率达到33.25%。由上述数据可知，菌丝三萜能够抑制LPS诱导下的巨噬细胞分泌INF-r，浓度25 μg·mL-1的菌丝三萜抑制效果最好。

图11 干扰素INF-r含量的标准曲线Fig.11 The standard curve of INF-r content

图12 鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对巨噬细胞中干素INF-r含量的影响Fig.12 The effect of mycelium triterpenes extraction from fevmentation of Sanghuangporus baumii on the content of interferon INF-r in macrophages

3 讨论

巨噬细胞是慢性炎症和自身免疫性疾病的关键细胞，在这些疾病中，活化的巨噬细胞可能发挥重要作用，促进炎症反应，并介导损伤的解决[24]。脂多糖可以激活巨噬细胞，并产生一氧化氮和释放细胞免疫因子等生物活性物质，适量的免疫因子可提高机体免疫力，而过量持续的刺激产生的免疫活性物质则会导致细胞的损伤和凋亡，引起细胞的炎症反应[25]。这表明巨噬细胞的有益或有害作用取决于其激活状态，而激活状态又由被占领的组织微环境所决定[26]。脂多糖所引起的过度炎症反应，极容易将细胞因子的保护性作用转化为损伤性作用，造成炎症过程失控，使得机体的免疫功能严重受抑，对器官造成不可逆的损害，因此需要研发更为安全有效的免疫调节剂。

一些真菌可以积累多种次生代谢物，包括有机酸、生物碱，萜类化合物、甾体化合物、酚类化合物和黄酮类化合物，这些次生代谢物具有广泛的用途，包括化妆品、医药和食品[27-28]。食用菌菌丝体、子实体和滤液中的多糖、糖蛋白、多肽、萜类和麦角甾醇等活性成分具有较强的抗肿瘤活性。早在20世纪60年代Chihara[29]就首次对食用菌活性成分多糖的抗肿瘤活性进行了评价，Kim等[30-31]从桑黄子实体中分离到一种糖蛋白，其不仅在体外选择性地刺激小鼠腹腔巨噬细胞的增殖，而且显著地提高了抗肿瘤的信息化学物质（NO和H2O2）的产生。Kim等[32]还证明了桑黄子实体中的提取物显著增加了B细胞增殖，刺激巨噬细胞释放细胞因子和一氧化氮。此外，从桑黄深层发酵菌丝体中的提取物通过促进淋巴细胞增殖和增加细胞因子TNF-α和信息化学物质一氧化氮的产生在体内表现出抗肿瘤活性[33-35]。但是对发酵菌丝三萜还缺乏比较系统的药理研究。

以鲍姆纤孔菌（Sanghuangporus baumii）发酵的菌丝体作为研究对象，考虑到栽培需要更多的时间来产生子实体，利用固态菌丝体获得生物活性成分是目前比较适用的方法，也被用作膳食补充剂或保健品的来源[36]。结果表明鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜对巨噬细胞RAW264.7的细胞没有毒性，并且不同的浓度可以提高细胞中溶菌酶、谷胱甘肽、糖原的含量，但是并不是随着浓度升高呈依懒性的增长，与一些多糖的作用结果不同[37]。有些化合物通过多种途径起作用，有些化合物的作用机理尚未明确[38]，有可能是由于发酵菌丝三萜为混合物，里面含有的不同单体对细胞的作用有所抑制。对ATP酶试验中，随着化合物浓度增加，其ATP酶含量有所减小，有可能是在激活小鼠腹腔巨噬细胞的过程中，同时存在较高水平的糖酵解[39]，需要较高的能量分解，随着化合物浓度的增加糖分解速度加大，导致ATP酶含量有所减少。

在分泌一氧化氮试验中，发现高浓度的发酵菌丝三萜可以促进巨噬细胞产一氧化氮的能力；鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜可以抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞产细胞因子，在设计的空白组、LPS模型组和药物对照组中，发现在脂多糖诱导巨噬细胞产细胞因子的过程中，模型组与空白组相比细胞因子的分泌会增加，而加入地塞米松的药物对照组与LPS模型组相比，会抑制其分泌过多的细胞因子。这说明鲍姆纤孔菌发酵菌丝三萜可以缓解巨噬细胞进入过度激活的状态，在一定程度上可以保护巨噬细胞。

目前对鲍姆纤孔菌研究仍不够深入，有必要对其进行活性成分系统研究，探索其有效成分与菌龄、菌种、培养条件和药效的关系[40]。分离纯化鲍姆纤孔菌发酵菌丝其他组分，明确鲍姆纤孔菌不同的有效成分在提高人体免疫机能，预防和治疗疾病方面的作用机制。这些深入细致的基础研究对合理地开发利用其在提高机体免疫力及其他药理活性方面的价值有着非常重要的意义。