王静之, 党芳志, 王 玲, 曹建刚, 敬 樊,毛仪楠

(商洛农业科学研究所,陕西 商洛 726000)

羊肚菌(MorchellaesculentaPers. et Amans)营养丰富，味道鲜美，富含人体所需的营养元素，是一种珍稀类野生食药用菌，几乎遍布我国各个省区[1～3]。自明代我国开始有关于羊肚菌药用功效的记载，但一直对其生物学特性缺乏深入了解[4～5]。2015年以来羊肚菌在商洛各地开始大面积人工栽培，但在母种保藏、分离和菌种培养方面依然存在许多问题。为进一步了解羊肚菌的生物学和营养学特性，本试验研究了在不同营养元素和浓度下羊肚菌菌丝的生物学特性，并绘制出菌丝生长曲线，以期明晰不同营养元素对菌丝生长的影响大小，筛选出能够加速或抑制菌丝生长的元素，从而优化母种培养基，为菌种培养、保藏、栽培生产和找出适宜羊肚菌母种分离和保藏的培养基的选择提供可供参考的依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株代号为1号，由陕西省微生物研究所提供。

1.2 试验配方

PDA固体培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g，水1 000 mL。

无碳培养基：硝酸钾15 g、琼脂18 g、水1 000 mL[1]。

无氮培养基：蔗糖20 g、磷酸二氢钾1.0 g、硫酸镁0.5 g、琼脂18 g、水1 000 mL[1]。

1.3 试验方法

1.3.1 羊肚菌的菌丝生长曲线 将供试羊肚菌菌株菌种块(直径4 mm)接在PDA平板培养基中心位置上，在23±1℃温度下培养，设置5个重复，采用十字交叉法，每12 h测定菌丝生长速度并绘制菌丝生长曲线。

1.3.2 不同磷酸二氢钾浓度下菌丝生长特性试验 供试菌株活化后，取直径4 mm的菌种块，分别接种于磷酸二氢钾含量为0 、0.01 g/100 mL、0.02 g/100 mL、0.03 g/100 mL、0.04 g/100 mL、0.05 g/100 mL的培养皿中，每个菌株5个重复，在23℃±1℃恒温箱中培养。每12h测量菌丝生长速度，观察记录菌丝颜色、长势、菌丝的浓密程度和气生菌丝的发达程度。

1.3.3 不同硫酸镁浓度下菌丝生长特性试验 供试菌株活化后，取直径4 mm的菌种块，分别接种于硫酸镁含量为0 mL、0.01 g/100 mL、0.02 g/100 mL、0.03 g/100 mL、0.04 g/100 mL、0.05 g/100 mL的培养皿中，每个菌株5个重复，在23℃±1℃恒温箱中培养。每12 h测量菌丝生长速度，观察记录菌丝颜色、长势、菌丝的浓密程度和气生菌丝的发达程度。

1.3.4 不同碳源对菌丝生长特性的影响试验 在无糖培养基中分别加入2%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、木糖醇、果糖、甘露糖、乳糖制成不同碳源培养基。供试菌株活化后，取直径4 mm的菌种块，分别接种于7种培养皿中，每个菌株5个重复，在23℃±1℃恒温箱中培。每12 h测量菌丝生长速度，观察记录菌丝颜色、长势、菌丝的浓密程度和气生菌丝的发达程度。

1.3.5 不同氮源对菌丝生长特性的影响试验 在无氮培养基中分别加入纯氮含量为0.2%的玉米粉、蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸钾、硝酸铵、麸皮制成7种不同氮源培养基。供试菌株活化后，取直径4 mm的菌种块，分别接种于不同氮源培养皿中，每个菌株5个重复，在23℃±1℃恒温箱中培养。每12 h测量菌丝生长速度，观察记录菌丝颜色、长势、菌丝的浓密程度和气生菌丝的发达程度；

1.3.6 不同淀粉浓度对菌丝生长特性影响试验 在无碳培养基中分别加入含量为1%、2%、3%、4%、5%、6%的淀粉。供试菌株活化后，取直径4 mm的菌种块，接种于不同淀粉浓度的培养皿中，每个菌株3个重复，在23℃±1℃恒温箱中培养。每12 h测量菌丝生长速度，观察记录菌丝颜色、长势、菌丝的浓密程度和气生菌丝的发达程度。

1.3.7 不同酵母膏浓度对菌丝生长特性影响试验 在无氮培养基中分别加入纯氮含量为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的酵母膏。供试菌株活化后，取直径4 mm的菌种块，接种于不同酵母膏浓度的培养皿中，每个菌株3个重复，在23℃±1℃恒温箱中培养。每12 h测量菌丝生长速度，观察记录菌丝颜色、长势、菌丝的浓密程度和气生菌丝的发达程度。

表1 羊肚菌母种培养基优化试验因素水平

1.3.8 母种培养基优化试验 根据试验1.3.4和1.3.5选取淀粉、酵母膏、磷酸二氢钾和硫酸镁为4个影响羊肚菌菌丝生理特性的因素，根据1.3.2、1.3.3、1.3.6、1.3.7确定4个因素适宜的3个水平，列出母种培养基优化试验因素水平表和L9(34)正交试验表，按照正交试验表给出的处理配制母种培养基。供试菌株活化后，取直径4 mm的菌种块，接种于不同培养基上，每个菌株3个重复，在23℃±1℃恒温箱中培养。每12 h测量菌丝生长速度，观察记录菌丝颜色、长势、菌丝的浓密程度和气生菌丝的发达程度。

表2 羊肚菌母种培养基优化正交试验

2 结果与分析

2.1 羊肚菌的菌丝生长曲线

由图1可以看出，在固体培养基上23℃±1℃培养5 h后，接种块萌发，培养12 h菌丝延长0.4 cm，菌落直径达1.2 cm，后随着培养时间增加菌丝长势增强，菌落直径增大。36 h到48 h菌丝延长1.06 cm，菌丝长势最强，菌落直径为6.43 cm。随后菌丝长势逐渐降低，菌落直径逐渐增大，直至长满平皿。

图1 PDA培养基上菌丝随时间的生长曲线

2.2 不同硫酸镁浓度对菌丝生长特性的影响试验

由表3可知，不同硫酸镁浓度下菌丝平均生长速度相当，均为2.13 cm/d，4 d长满平皿。和对照组相比，5个浓度梯度培养基上菌丝生长速度和菌丝浓密度、气生菌丝旺盛程度差异不大。在培养过程中，硫酸镁浓度为0.01%和0.03%培养基上菌落直径最大。0.04%和0.05%时菌丝稀疏细弱、气生菌丝少，菌落颜色浅。综合菌丝生长速度、长势分析，0.03%硫酸镁为最适宜羊肚菌菌丝生长的培养基。

表3 不同硫酸镁浓度下菌丝生长特性

2.3 不同磷酸二氢钾浓度对菌丝生长特性的影响试验

由表4可得，磷酸二氢钾浓度为0.00%、0.01%、0.02%时菌丝平均生长速度快，为2.43 cm/d，3.5 d菌丝长满平皿，其余浓度菌丝平均生长速度相当，均为2.13 cm/d，4 d长满平皿。磷酸二氢钾浓度为0.01%和0.02%时，培养基上菌丝整个生长过程中菌落直径与对照相当；磷酸二氢钾浓度为0.03%、0.04%、0.05%培养基上菌丝整个生长过程中菌落直小于对照组，且相同时间上，磷酸二氢钾浓度越大菌落直径越小。综合菌丝生长速度、长势分析，0.02%磷酸二氢钾为最适宜羊肚菌菌丝生长的培养基。

表4 不同磷酸二氢钾浓度下菌丝生长特性

2.4 不同碳源对菌丝生长特性影响试验

由表5可得，不同碳源培养基上菌丝生长随时间变化的一致，符合菌丝在固体培养基上生长曲线的变化。但不同碳源培养基上菌丝生长速度、菌丝浓密程度、菌丝颜色等都存在差异。3号培养基(淀粉)菌丝平均生长速度最快，为2.43 cm/d，3.5 d菌丝长满平皿，菌丝白色、健壮、浓密。4号培养基(α-乳糖)菌丝平均生长速度为2.00 cm/d，4d菌丝长满平皿，菌丝白色、健壮、浓密。1号(葡萄糖)、2号(蔗糖)培养基菌丝平均生长速度相当为1.77 cm/d，4.5 d菌丝长满平皿，菌丝菌丝白色、健壮、浓密。5号(木糖醇)、6号(甘露醇)培养基菌丝平均生长速度相当为1.70 cm/d，5d菌丝长满平皿，菌丝稀疏、细弱、透明。7号(D-果糖)培养基菌丝平均生长速度为1.54 cm/d，5.5 d长满平皿，菌丝稀疏、细弱、透明。综合菌丝生长速度、长势分析，淀粉为最适宜羊肚菌菌丝生长的培养基碳源。

表5 不同碳源培养基各菌丝生长特性

2.5 不同氮源对菌丝生长特性影响试验

由表6可得，不同氮源培养基上菌丝生长随时间变化一致(4号培养基除外)，菌丝在固体培养基上的变化符合生长曲线，但不同氮源培养基上菌丝生长速度、菌丝浓密程度、菌丝颜色等都存在差异，1号(玉米粉)菌丝平均生长速度最快，为3.4 cm/d，2.5 d长满平皿，菌丝灰白、较浓密；7号(麸皮)菌丝平均生长速度为2.83 cm/d，3 d长满平皿，菌丝灰白、一般浓密，中心菌丝稀疏，边缘菌丝旺盛；2号(蛋白胨)、3号(酵母膏)菌丝平均生长速度相同，均为2.43 cm/d，3.5 d长满平皿，菌丝灰白、边缘整齐、健壮且浓密、气生菌丝旺盛；5号(硝酸钾)菌丝平均生长速度为2.13 cm/d，4 d长满平皿，中心菌丝旺盛、较浓密，边缘菌丝较稀疏；6号(硝酸铵)菌丝平均生长速度为1.78 cm/d，4.5 d长满平皿，中心菌丝浓密，灰白，气生菌丝旺盛，边缘菌丝稀疏；4号(尿素)培养7 d，菌种块一直未萌发。综合菌丝生长速度、长势分析，酵母膏为最适宜羊肚菌菌丝生长的培养基氮源。

表6 不同氮源培养基各菌丝生长特性

2.6 不同淀粉浓度对菌丝生长特性影响试验

由表7可得，不同淀粉含量培养基上菌丝生长特性存在差异。淀粉浓度为6%时，菌丝平均生长速度最快，为2.83 cm/d，3.0 d长满平皿，菌丝灰白、浓密、气生菌丝旺盛。淀粉浓度为2%、3%、4%、5%、6%，菌丝平均生长速度相当，均为2.83 cm/d，3 d长满平皿。淀粉浓度为1%时，菌丝平均生长速度最慢，为2.43 cm/d，3.5 d长满平皿。综合菌丝生长速度、每12 h观察菌落分析长势可得，在生长过程中菌落直径、菌丝浓密度和气生菌丝旺盛度与淀粉浓度均成正比，6%淀粉为最适宜羊肚菌菌丝生长的培养基碳源浓度。

表7 不同淀粉浓度培养基上菌丝生理特性

2.7 不同酵母膏浓度对菌丝生长特性影响试验

由表8可得,不同酵母膏纯氮含量培养基上菌丝生长特性存在差异。培养基中纯氮浓度为0.1%时，菌丝平均生长速度最快，为2.83 cm/d，3.5 d长满平皿，菌丝浓密、气生菌丝旺盛，菌落边缘长势一致，菌丝灰白；纯氮浓度为0.2%、0.3%时，菌丝平均生长速度为2.13 cm/d，4 d长满平皿，且纯氮浓度0.2%培养基上的菌落直径更大、菌丝更浓密。纯氮浓度为0.4%、0.5%时，菌丝平均生长速度均为1.89 cm/d，4.5 d长满平皿，生长过程中，且纯氮浓度0.4%培养基菌落直径更大、菌丝更浓密。纯氮浓度0.6%时，接种块32 h后萌发，晚于其他组，菌丝平均生长速度最慢，为1.70 cm/d，5.0 d长满平皿，生长过程中菌落直径均处于最低，菌丝稀疏、气生菌丝少。综合菌丝生长速度、每12 h观察菌落分析长势可得，在生长过程中菌落直径、菌丝浓密度和气生菌丝旺盛度与酵母膏纯氮含量浓度均成反比，0.1%酵母膏纯氮含量为最适宜羊肚菌菌丝生长的培养基氮源浓度。

表8 不同浓度培养基上菌丝生理特性

2.8 母种培养基优化试验

由表9、表10采用正交试验直观分析法，结合不同培养基上菌丝生理特性表可知，羊肚菌母种培养基最佳配方为：淀粉6%，酵母膏纯氮含量0.1%，磷酸二氢钾0.03%，硫酸镁0.02%，其菌丝生长速度最快，为3.40cm/d，2.5d长满平皿，菌丝浓密，气生菌丝旺盛。羊肚菌母种培养基优化试验各因素对菌丝生长速度影响的大小为：酵母膏>硫酸镁>淀粉>磷酸二氢钾。

表9 不同处理培养基上菌丝生理特性

表10 母种培养基优化试验正交

3 结论与讨论

羊肚菌菌丝在PDA培养基上的生长曲线符合微生物生长曲线规律，有着生长迟缓期、快速生长期、迟滞期3个阶段。接种后12h内接种块恢复适应新环境后萌发，蔓延至培养基上，12～48h菌丝进入快速生长期，菌丝快速增加，48h后菌丝长速逐渐变慢，最后至菌丝长满平皿。

在PDA培养基上添加硫酸镁、磷酸二氢钾，菌丝平均生长速度、菌丝浓密度、气生菌丝旺盛和菌落颜色与对照组差异不大。

不同碳源培养基上菌丝生理特性存在统一性和差异性。一致性为：生长过程中，菌落边缘整齐，菌丝长势一致，呈灰白色。差异性为：每种碳源的菌丝生理特性不一，其中淀粉为碳源时菌丝生理特性表现最好，菌丝生长速度明显加快，菌丝浓密健壮，气生菌丝旺盛，中心菌丝和边缘菌丝一致，淀粉含量与菌落直径、菌丝浓密度和气生菌丝旺盛均呈正比，培养基中最佳淀粉含量为6%。其次为葡萄糖、蔗糖，菌丝生长速度居中，菌丝浓密健壮，但培养时间越长，中心菌丝老化，蔗糖更明显；以乳糖为碳源，菌丝生长速度仅次于以淀粉为碳源，但菌丝长势一般；以木糖醇、甘露醇、果糖为碳源，菌丝生长速度慢，果糖最慢，菌丝细弱、稀疏，气生菌丝少。因此羊肚菌母种培养基碳源可以选择淀粉、葡萄糖、蔗糖。

不同氮源培养基上菌丝生理特性存在统一性和差异性。一致性为：生长过程中，菌落边缘整齐，菌丝长势一致，呈灰白色。差异性为：每种氮源的菌丝生理特性不一，以酵母膏为氮源时菌丝生理特性表现最好，菌丝生长速度快，菌丝长势整齐，菌丝中心和边缘长势一致，菌丝浓密，气生菌丝旺盛，酵母膏含量与菌落直径、菌丝浓密度和气生菌丝旺盛均呈反比，培养基中最佳纯氮含量为0.1%。以玉米粉为氮源时，菌丝生长速度最快，菌丝较浓密，气生菌丝较旺盛；以蛋白胨为氮源时，菌丝生长速度快，菌丝浓密，气生菌丝旺盛，这是由于玉米粉、蛋白胨、酵母膏为混合物，营养成分复杂，除含有氮源，也高含淀粉、单糖、多糖、维生素、无机盐等物质，富含菌丝生长所需营养。以单一无机盐硝酸钾或硝酸铵为氮源菌丝生长速度比以有机物为氮源慢，两种无机盐各有优点，硝酸钾为氮源菌丝生长速度更快，硝酸铵为氮源中心菌丝更加浓密，气生菌丝更加旺盛。麸皮为氮源菌丝生长速度仅次于玉米粉为氮源，但菌丝较弱，且随着时间延长中心菌丝变细弱，菌丝老化。尿素作为氮源菌丝不萌发，可能因为尿素对热不稳定，加热至150～160℃将脱氨成缩二脲，在高压灭菌条件下，尿素脱氨形成缩二脲，使培养基中缩二脲浓度过高，对菌丝产生抑制作用，导致菌丝不萌发。因此羊肚菌母种培养基氮源优选酵母膏，也可以选择玉米粉、蛋白胨。

通过正交试验直观分析法得出，各因素对菌丝生长速度影响的大小为：酵母膏>硫酸镁>淀粉>磷酸二氢钾。羊肚菌母种培养基最佳配方为：淀粉6%，酵母膏纯氮含量0.1%，磷酸二氢钾0.03%，硫酸镁0.02%。