何金花，刘丹枫，高丽娟，马红敏

石家庄市第二医院内分泌科，河北石家庄 050000

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)是常见的呼吸系统疾病，也是糖尿病常见的并发症[1-2]。2型糖尿病患者长期处于高糖状态，可能会发生高糖毒性和脑细胞缺氧状态，从而损伤呼吸中枢神经系统，导致OSAHS发生[3]。有研究显示，敲除微小RNA-34a(miR-34a)基因可激活Notch1/低氧诱导因子-1α(HIF-1α)信号通路，减轻脑缺血再灌注对大鼠脑组织损伤和神经元凋亡的影响[4]。miR-34a可通过靶向调节沉默信息调节因子1(SIRT1)加重高糖状态下骨髓间充质干细胞的衰老，从而促进糖尿病患者并发症发生[5]。由此推测miR-34a及SIRT1可能与OSAHS发生相关。本研究拟探讨miR-34a、SIRT1在2型糖尿病合并OSAHS患者血清中水平，以及二者单独及联合检测对2型糖尿病合并OSAHS的诊断价值，旨在为2型糖尿病合并OSAHS的治疗提供新靶点。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年4月至2020年3月石家庄市第二医院收治的单纯2型糖尿病患者70例(单纯2型糖尿病组)，2型糖尿病合并OSAHS患者60例(2型糖尿病合并OSAHS组)为研究对象。单纯2型糖尿病组男37例，女33例；年龄45～80岁，平均(61.82±9.31)岁。2型糖尿病合并OSAHS组男31例，女29例；年龄45～80岁，平均(61.98±9.45)岁。纳入标准：(1)患者符合《中国2型糖尿病防治指南(2017年版)》中关于2型糖尿病的诊断标准[6]；(2)2型糖尿病患者均行Epworth嗜睡量表(ESS)初筛，ESS≥7分者行多导睡眠图(PSG)监测，OSAHS符合2011年中华医学会制定的《阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征诊治指南(2011年修订版)》诊断标准[7]；(3)临床资料完整者。排除标准：(1)合并慢性阻塞性肺疾病及急慢性感染患者；(2)合并有内分泌疾病如甲状腺功能减退症、痛风等患者；(3)中枢性、混合性OSAHS患者；(4)酮症酸中毒、乳酸酸中毒患者；(5)合并严重心脑血管疾病及严重功能障碍患者；(6)合并肿瘤患者。单纯2型糖尿病组与2型糖尿病合并OSAHS组在性别、年龄上差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。患者及家属同意签署知情同意书，本研究通过本院伦理委员会批准。

1.2试剂与仪器 RNA提取试剂盒(货号：R1200-100，购自北京索莱宝科技有限公司)；cDNA第一链合成试剂盒(货号：60906-10，购自上海信裕生物科技有限公司)；SYBR Green PCR Kit荧光定量PCR试剂盒(货号：KL101-969，购自上海康朗生物科技有限公司)；SIRT1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号：K4923-100，购自艾美捷科技有限公司)；CFX96型实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪(购自德国Bio-Rad公司)；邦德安百多导睡眠监测系统[注册号：国食药监械(进)字2005第2212944号，购自北京杰富瑞科技有限公司]。

1.3方法

1.3.1样品采集 所有患者入院当天清晨空腹时采集静脉血4～6 mL装于采血管中，在4 ℃、3 500 r/min转速下离心20 min，留取上清液，冻存于-80 ℃冰箱中，待测。

1.3.2血清中miR-34a表达水平的检测 RNA试剂盒提取血清中总RNA，以逆转录得到的cDNA为模板。采用qRT-PCR仪对miR-34a及内参U6进行扩增反应。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，38个循环；72 ℃ 3 min。总反应体系(10 μL)：cDNA 2 μL、正向引物0.5 μL、反向引物0.5 μL、SYBR Green PCR Kit 2 μL、ddH2O 5 μL。miR-34a正向引物5′-GGC AGT GTC TTA GCT GGT TG-3′，反向引物5′-AAG AGC TTC CGA AGT CCT GG-3′；内参U6正向引物5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′，反向引物5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。引物由上海生工合成。miR-34a相对表达量用2-ΔΔCt法计算。

1.3.3血清中SIRT1水平的检测 采用ELISA法检测血清中SIRT1水平，操作步骤严格依据SIRT1 ELISA试剂盒进行。

1.3.4临床资料的收集 记录患者糖尿病病程、体质量指数(BMI)、空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等资料。采用邦德安百多导睡眠监测系统对2型糖尿病患者每晚监测PSG，时间大于7 h，记录患者每小时低通气次数或呼吸暂停次数，获得睡眠呼吸暂停低通气指数(AHI)。

2 结 果

2.1两组临床指标的比较 单纯2型糖尿病组、2型糖尿病合并OSAHS组的TG、TC、LDL-C、HDL-C、BMI、HbA1c水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与单纯2型糖尿病组相比，2型糖尿病合并OSAHS组患者糖尿病病程较长(P<0.05)，FBG水平及AHI较高(P<0.05)，见表1。

表1 两组患者临床指标的比较

续表1 两组患者临床指标的比较

2.2两组患者血清miR-34a、SIRT1水平比较 与单纯2型糖尿病组相比，2型糖尿病合并OSAHS组患者血清miR-34a表达水平较高(P<0.05)，SIRT1水平较低(P<0.05)，见表2。

表2 两组血清miR-34a、SIRT1水平比较

2.32型糖尿病合并OSAHS患者血清miR-34a与SIRT1相关性分析 miRtarBase网站预测，miR-34a与SIRT1存在结合位点；Pearson相关分析显示，血清miR-34a表达水平与SIRT1水平呈负相关(r=-0.823，P<0.05)。

2.4血清miR-34a、SIRT1单独及联合检测对2型糖尿病合并OSAHS的预测价值 ROC曲线分析结果显示，miR-34a、SIRT1水平单独检测诊断2型糖尿病合并OSAHS的曲线下面积(AUC)分别为0.846、0.835，灵敏度分别为65.00%、70.00%，特异度分别为88.60%、88.30%，截断值分别为3.06、0.67 ng/mL；二者联合检测诊断2型糖尿病合并OSAHS的AUC为0.935，灵敏度为87.10%，特异度为85.00%。

3 讨 论

2型糖尿病与OSAHS在临床上相互影响，2型糖尿病患者血糖控制不佳会加重OSAHS，OSAHS也可以加重胰岛素抵抗，促进糖尿病发生。本研究发现，与单纯2型糖尿病组相比，2型糖尿病合并OSAHS组患者糖尿病病程较长，FBG水平较高，提示2型糖尿病患者并发OSAHS可能是由于长时间血糖控制不佳导致的。此外糖尿病患者机体在应激状态下，可发生支气管舒缩张力异常，加重OSAHS病情[8-9]。OSAHS患者在睡眠过程中，机体可反复出现低氧与二氧化碳滞留现象，间歇性的缺氧再复氧过程，可作用于中枢交感神经调控部位，使神经发生兴奋。miRNA可参与细胞的分化和调亡，从而调控基因表达的生物功能[10]。因此，探讨miRNA在2型糖尿病合并OSAHS发生过程中的作用可为临床早期治疗患者提供理论依据。

miR-34家族具有进化保守性，由miR-34a、miR-34b、miR-34c组成，miR-34a位于染色体1q36.22上，是心血管疾病的重要调控因子，也可参与调控氧化应激和短暂的缺氧、复氧导致的细胞凋亡[11]。另外miR-34a的表达与高血糖诱导的血管功能障碍也有关[12]。受高糖刺激后，人视网膜微血管内皮细胞miR-34a呈高表达，且miR-34a通过改变线粒体功能参与氧化应激，从而促进视网膜微血管内皮细胞衰老[13]。miR-34a是与缺氧-复氧损伤相关的细胞死亡和细胞存活的多功能调节因子，并已报道通过靶向p53在癌细胞中诱导凋亡和细胞周期阻滞[14]。本研究发现，2型糖尿病合并OSAHS组患者血清miR-34a表达水平显著高于单纯2型糖尿病组患者，提示miR-34a可能影响2型糖尿病合并OSAHS的发生，可能原因为在高糖状态下，miR-34a影响细胞功能，进而促进OSAHS疾病发生；也可能通过调控氧化应激和细胞凋亡从而促进2型糖尿病合并OSAHS的发生。

miR-34a是SIRT1的翻译抑制因子[15-17]。miRtarBase网站预测，miR-34a与SIRT1存在结合位点，Pearson相关分析显示，血清miR-34a表达水平与SIRT1水平呈负相关(r=-0.823,P<0.05)，提示miR-34a可能调控SIRT1参与糖尿病合并OSAHS的发生。LIN等[18]发现，miR-34a在2型糖尿病小鼠耳蜗毛细胞中呈高表达，并抑制SIRT1表达，高表达的miR-34a可促进2型糖尿病小鼠耳蜗毛细胞凋亡。刘金泉等[19]研究证实miR-34a低表达可通过靶向上调SIRT1抑制帕金森病模型细胞凋亡和氧化应激损伤。BADI等[20]研究发现在人主动脉平滑肌细胞中，miR-34a过度表达，且miR-34a通过下调SIRT1表达，抑制细胞增殖并诱导细胞衰老，通过血管平滑肌矿化促进血管钙化。血管钙化可诱导心脑血管疾病发生[21]。本研究发现2型糖尿病合并OSAHS组患者血清SIRT1水平显著低于单纯2型糖尿病组患者，提示SIRT1可能参与2型糖尿病合并OSAHS的发生。ROC曲线分析结果显示，miR-34a、SIRT1水平单独检测诊断2型糖尿病合并OSAHS的AUC分别为0.846、0.835，二者联合检测诊断2型糖尿病合并OSAHS的AUC为0.935，灵敏度为87.10%，特异度为85.00%，miR-34a与SIRT1联合检测时灵敏度均高于二者单独检测时灵敏度，提示检测患者miR-34a与SIRT1水平对临床上诊断2型糖尿病合并OSAHS可能具有一定的参考价值。

综上所述，2型糖尿病合并OSAHS患者血清miR-34a表达水平上调，SIRT1表达水平下调，miR-34a与SIRT1的检测对诊断2型糖尿病合并OSAHS发生具有一定的临床参考价值，二者联合检测效果可能更好。