1.济南大学-山东省医学科学院医学与生命科学学院（山东 济南 250200）

2.山东省罕少见病重点实验室,山东省医药生物技术研究中心,山东省医学科学院(山东 济南 250062)

左清利1,2 鲁艳芹1,2 韩金祥1,2

·胸部疾病·

呼吸道感染样本中IFITMs引物优化

1.济南大学-山东省医学科学院医学与生命科学学院（山东 济南 250200）

2.山东省罕少见病重点实验室,山东省医药生物技术研究中心,山东省医学科学院(山东 济南 250062)

左清利1,2鲁艳芹1,2韩金祥1,2

目的优化干扰素诱导的跨膜蛋白（Interferon induced transmenmbrane proteins,IFITMs）的五个亚型基因，即IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10。方法提取呼吸道感染样本中核酸，通过RT-qPCR筛选出具有特异性的引物且Ct值在[15,35]之间，再利用琼脂糖凝胶电泳对引物的特异性进行近一步的验证。结果RT-qPCR结果显示IFITM1相关引物中IFITM1-3具有特异性；IFITM2相关引物中IFITM 2-2具有特异性；IFITM3相关引物IFITM3-2有较好特异性；IFITM5相关引物中IFITM5-4具有特异性；IFITM10相关引物中IFITM10-1、IFITM10-2、IFITM10-3具有特异性。具有特异性的所有引物的琼脂糖凝胶电泳条带单一明亮。结论IFITM1-3优于该基因的其它引物；IFITM2-2优于IFITM2-1；IFITM3-2优于IFITM3-1；IFITM10-1、 IFITM10-2 和IFITM10-3均适用。

呼吸道感染；引物；IFITMs

全球近二百万的儿童死亡病例是由于急性呼吸道感染(ARI)导致的[1]。病毒是呼吸道感染的主要病原体，如呼吸道合胞病毒、腺病毒和偏肺病毒等[2]。小儿支原体肺炎也是儿科常见疾病，利用阿奇霉素序贯疗法进行治疗能迅速缓解患儿临床症状[3]。干扰素诱导跨膜蛋白(interferon inducible transmembrane proteins，IFITM)[4]在人类中包括5个基因，分别是IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10，位于11号染色体上。IFITM1、IFITM2和IFITM3的抗病毒效应一直是研究的热点，但IFITM5和IFITM10在呼吸道病毒感染中的研究尚未报道。

1 材料与方法

1.1 实验材料呼吸道感染患者的肺泡灌洗液来源于山东省济南市儿童医院。

1.2 试剂仪器QIAamp MinElute Virus Spin Kit，购于QIAGEN。One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR Kit、6xLoading Buffer、DL2000 DNA marker均购于TAKARA。Nanodrop2000，购于Thermo Scientific。LightCycler480，购于Roche。EB核酸染料，购于中生泰瑞。

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计：查找GENEBANK中IFITMs基因序列设计引物：IFITM1(NM_003641)，IFITM1-1上游引物：5’-GAGAGAGGCCTGCGACAA-3’，下游引物：5’-CGTTTCAGTTTCTCAGAAGTGTG-3’；IFITM1-2上游引物：5’-AGGCCTGCGACAAGTGAG-3’，下游引物：5’-TGGAACCTTGGAAGGATGGT-3’；IFITM1-1上游引物：5’-GAGAGAGGCCTGCGACAA-3’，下游引物：5’-CGTTTCAGTTTCTCAGAAGTGTG-3’；IFITM1-2上游引物：5’-AGGCCTGCGACAAGTGAG-3’，下游引物：5’-TGGAACCTTGGAAGGATGGT-3’；IFITM1-3上游引物：5’-TCGCCTACTCCGTGAAGTCT-3，下游引物：5’-ATGAGGATGCCCAGAATCAG-3’；IFITM1-4上游引物：5’-CCGTGAAGTCTAGGGACAGG-3’，下游引物：5’-GTCATGAGGATGCCCAAGAAT-3’。

IFITM2(NM_006435)，IFITM2-1上游引物：5’-GCCTGGGCTTCATAGCATT-3’，下游引物：5’-CATGGGGTGAAGTCACCTGT-3’；IFITM2-2上游引物：5’-CTCCGTGCCTGACCATGT-3’，下游引物：5’-ACGTCGCCAACCATCTTC-3’。IFITM3(NM_021034)，IFITM3-1上游引物：5’-GCCTGGGCTTCATAGCATT-3’，下游引物：5’-CATGGGGTGAAGTCACCTGT-3’；IFITM3-2上游引物：5’-TCCCTGTTCAACACCCTCTT-3’，下游引物：5’-CGCCAACCATCTTCCTGT-3’。

IFITM5(NM_001025295)，IFITM5-1上游引物：5’-TTGATCTGGTCGGTGTTCAG-3’，下游引物：5’-CAGGTCACCAACCACCTTCT-3’；IFITM5-2上游引物：5’-GGTGTTCAGCACCCTCTACC-3’，下游引物：5’-CAGGTCACCAACCACCTTCT-3’；IFITM5-3上游引物：5’-CGGTGTTCAGCACCCTCTAC-3’，下游引物：5’-CCAACCACCTTCTGATCTCG-3’；IFITM5-4上游引物：5’-GGTGTTCAGCACCCTCTACC-3’，下游引物：5’-TGTAGCACTTGGCTTTGGAG-3’。

IFITM10(NM_001170820)，IFITM10-1上游引物：5’-GCCATGCATCCTCAGCTT-3’，下游引物：5’-CTCCAGCTCCCACTGAGC-3’；IFITM10-2上游引物：5’-CCACCGAGGTGAACGACTAT-3’，下游引物：5’-TCGCACTTTGAGGGAGTAGG-3’；IFITM10-3上游引物：5’-TGGTCCATCTTCAACTTCGTC-3’，下游引物：5’-TCGCACTTTGAGGGAGTAGG-3’；IFITM10-4上游引物：5’-TGGTCCATCTTCAACTTCGTC-3’，下游引物：5’-TCTTGTCTCGCACTTTGAGG-3’。

1.3.2 核酸提取及定量：通过QIAamp MinElute Virus Spin Kit提取肺泡灌洗液中的游离核酸。用60μl洗脱两次，并分别用Nanodrop2000核酸蛋白检测仪进行核酸定量，标记后于-80℃储存备用。

1.3.3 RT-qPCR：应用One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR Kit，10μl体系，每个反应加2xOne Step SYBRRT-PCR Buffer 5μl；PrimeScript Rtase 0.2μl； Mix TaKaRa Ex Taq HS Mix 0.6μl；上游、下游引物(10μm)均为0.5μl；Template，20ng；RNase- free ddH2O，补充至10μl。

首先反转录反应，在42℃下反应5min；其次预变性，在95℃下反应10s；然后引物扩增反应45个循环(95℃，10s；60℃，10s；72℃，10s)，熔解曲线反应1个循环(95℃，5s；65℃，1min；97℃，0.11℃/ s)。冷却40℃，30s。

2 结 果

IFITM1熔解曲线见图1。IFITM1-1重合度不好，IFITM1-2无扩增，IFITM1-4无特异性。IFITM2熔解曲线见图2。IFITM2-1引物Ct值为38.06＞35。IFITM3熔解曲线见图2。IFITM3-1引物无扩增，IFITM3-2平行反应引物重合度好，无双峰。

IFITM5熔解曲线见图3。IFITM5-1、IFITM5-2特异性差，有双峰。除IFITM5-4Ct值为24.96，其余引物Ct值均大于35。IFITM10熔解曲线见图4。除IFITM10-4无特异性外，其余引物特异性均较好。

3 结 论

IFITM家族蛋白之间的功能有区别，如Everitt等[5]发现IFITM3尤其对甲型流感病毒有显著限制作用。本实验通过设计IFITMs相关引物，利用呼吸道感染患者肺泡灌洗液中的游离核酸，根据Ct值大小及熔点曲线峰特异性等结果筛选扩增引物。旨在为分析呼吸道感染样本中IFITM家族在mRNA水平上的表达提供依据。

通过分析IFITM1-3优于该基因的其它引物；IFITM2-2优于IFITM2-1；IFITM3-2熔解曲线特异性好，而IFITM3-1无扩增，IFITM3-2优于IFITM3-1；IFITM5-4熔解曲线特异性好。IFITM10-1、IFITM10-2和IFITM10-3均有较好特异性，而IFITM10-4特异性差，出现了双峰且Ct＞35。

另外，在呼吸道感染患者的肺泡灌洗液中发现了IFITM5在mRNA水平上亦有表达，这与文献中IFITM5仅在骨骼中表达的说法不一 致[6]，这种现象还未得到明确解释。IFITM蛋白抵抗病毒入侵的机制还有待进一步研究。本实验旨在为呼吸道感染样本中IFITM家族在抵抗病毒分子机制额研究提供依据。

[1] Rowlinson E, Dueger E, Mansour A, et al. Incidence and etiology of hospitalized acute respiratory infections in the Egyptian Delta[J]. Influenza & Other Respiratory Viruses,2016,11(1): 23-32.

[2] 刘洁,李医,李辉,等.128例急性上呼吸道感染患儿病原学检测分析[J].医学信息,2015, (33): 356-357.

[3] 曾远辉.阿奇霉素序贯疗法治疗小儿支原体肺炎的临床疗效及安全性分析[J]. 罕少疾病杂志, 2015, 22(3): 17-19.

[4] Diamond M SFarzan M. The broad-spectrum antiviral functions of IFIT and IFITM proteins[J]. Nature Reviews Immunology,2013, 13(1): 46-57.

[5] Everitt A, Clare S, Pertel T, et al. IFITM3 restricts the morbidity and mortality associated with influenza[J]. Nature,2012, 484(7395): 519.

[6] Moffatt P, Gaumond M H, Salois P, et al. Bril: a novel bonespecific modulator of mineralization[J]. Journal of Bone & Mineral Research the Official Journal of the American Society for Bone & Mineral Research, 2008, 23(9): 1497.

（本文图片见封二）

Optimization of IFITMs Primers in Respiratory Tract infection Samples

ZUO Qing-li, LU Yan-qin, HAN Jin-xiang. University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250200, Shandong Province, China

ObjectiveTo optimize the five subtypes of interferon inducible transmembrane proteins, namely IFITM1, IFITM2, IFITM3, IFITM5 and IFITM10.MethodsExtraction of nucleic acids from respiratory tract infection samples. Specific primers were screened by qRT-PCR and Ct value was between (15,35), and the specificity of primers was verified by agarose gel electrophoresis.ResultsIFITM1-3 was specific in the IFITM1 primers. IFITM 2-2 was specific in the IFITM2 primers. IFITM3-2 was specific in the IFITM3 primers. IFITM5-6 was specific in the IFITM5 primers. IFITM10-1, IFITM10-2 and IFITM10-3 were specific in the IFITM10 primers. Agarose gel electrophoresis bands of all primers with specificity were single bright.ConclusionIFITM1-3 was superior to other primers of IFITM1 primers. IFITM 2-2 was superior to other primers of IFITM2 primers. IFITM3-2 was superior to other primers of IFITM3 primers. IFITM5-4 was superior to other primers of IFITM5 primers. IFITM10-1, IFITM10-2 and IFITM10-3 were superior to other primers of IFITM10 primers.

Respiratory Tract Infection; Primer; IFITMs

R373.1

A

DOI:10.3969/j.issn.1009-3257.2017.02.009

2017-04-07

左清利，男，药学专业，硕士研究生，主要研究方向：呼吸道感染样本中IFITMs的表达差异

韩金祥