唐 越，李欣雨，彭钰凌，贺吉春，李秋香，伍怡颖

成都医学院药学院，四川成都 610000

结直肠癌是消化道常见恶性肿瘤，其发病率在癌症中位于前4位[1-3]。结直肠癌早期不容易被发现，患者确诊时已错过手术治疗最佳时间，同时，该病具有较高的复发及转移率[4-5]，因此大多数患者需要接受传统放化疗改善预后[6]。但化学治疗药物的不良反应较多，而天然药物具有多种优势，例如毒性小、靶点多等[7]。

异甘草素(ISL)主要来源于植物甘草，具有增强免疫功能、减轻炎症等作用[8-10]。近来在卵巢癌、宫颈癌等多种肿瘤的相关研究中发现，ISL有较好的抗肿瘤作用[11-12]。但其对结直肠癌的作用及抗癌机制还不清楚。因此，本研究拟从体内外两方面探讨ISL对结直肠癌的抑制作用。

1 材料与方法

1.1材料 人结直肠癌细胞株HCT-116、SW480和小鼠结直肠癌细胞株CT26购自中国科学院上海生物科学研究所细胞库；ISL购自美伦生物科技有限公司；溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)购自碧云天生物有限公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒购自凯基生物技术发展有限公司。

1.2方法

1.2.1MTT法测定ISL对HCT-116、SW480细胞体外增殖的影响 将HCT-116、SW480细胞以1×104个/孔铺于96孔板。待贴壁后，HCT-116细胞分别加入梯度浓度的ISL(10、20、40、60、80、100 μmol/L)，同样SW480细胞中也加入梯度浓度的ISL(20、60、100、140、180、220 μmol/L)，对照组细胞不经药物处理。24 h后，每孔分别加入10 μL MTT，4 h后，加二甲基亚砜(DMSO)，于酶标仪490 nm波长处检测光密度值。

1.2.2流式细胞术检测ISL对HCT-116、SW480细胞凋亡的影响 将HCT-116、SW480细胞以2×105个/孔铺于6孔板。待贴壁后，加入不同浓度的ISL处理24 h，按说明书收集细胞，加入Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶(PI)染色，于流式细胞仪检测。

1.2.3流式细胞术检测ISL对HCT-116、SW480细胞周期的影响 将HCT-116、SW480细胞以2×105个/孔铺于6孔板。待贴壁后，加入不同浓度的ISL(20、40、60、80 μmol/L)处理24 h，按说明书收集固定细胞，PI染色，于流式细胞仪检测。

1.2.4划痕实验分析ISL对HCT-116、SW480细胞迁移力的影响 将HCT-116、SW480细胞以5×105个/孔铺于6孔板。待贴壁后，加入不同浓度的ISL进行干预。用10 μL移液枪头在孔板内底部轻划3～5条等距平行线，显微镜下拍照初始划痕距离。待ISL作用24、48、72 h后，分次取出6孔板，显微镜下拍照、观察。

1.2.5复制CT-26荷瘤小鼠模型观察ISL对小鼠移植瘤生长的影响 将CT26细胞制成浓度为1×107个/毫升的细胞悬液。取雄性BALB/C小鼠，于右侧腋下注射CT26细胞，每只100 μL，复制小鼠结直肠癌移植瘤模型。当小鼠腋下肿瘤生长到40～50 mm3时，将体质量和肿瘤大小较一致的小鼠选出，共18只，随机分为ISL低浓度组、ISL高浓度组和阴性对照组，每组6只。并按分组给药，低浓度组腹腔注射ISL 30 mg/(kg·d)，高浓度组腹腔注射ISL 60 mg/(kg·d)，阴性对照组腹腔注射蒸馏水100 μL/[(10 g)·d]。每天记录小鼠的体质量和腋下肿瘤体积。10 d后，处死全部小鼠，剥取肿瘤并称取质量。采用4%的多聚甲醛固定瘤块，常规脱水、石蜡包埋、切片、染色、显微镜下拍照、观察。

2 结 果

2.1ISL在体外对结直肠癌细胞增殖情况的影响 MTT法检测结果显示，结直肠癌细胞增殖率随ISL浓度的升高而显著降低(P<0.01)。ISL浓度为20、40、60、80、100 μmol/L时，HCT-116细胞增殖抑制率分别为(11.05±2.84)%、(27.94±6.69)%、(50.64±5.68)%、(56.25±4.24)%、(70.65±3.86)%。SW480细胞在ISL浓度为60、100、140、180、220 μmol/L时的细胞增殖抑制率分别为(34.25±1.79)%、(40.63±1.44)%、(50.11±3.15)%、(81.50±1.06)%、(58.62±3.25)%。结果表明ISL可呈浓度依赖性的抑制结直肠癌细胞体外增殖。

2.2ISL对结直肠癌细胞凋亡情况的影响 在ISL干预24 h后，HCT-116细胞及SW480细胞凋亡率较对照组明显升高(P<0.01)。HCT-116细胞在80 μmol/L的ISL作用后，总凋亡率为(72.22±5.48)%。SW480细胞在180 μmol/L的ISL作用后，总凋亡率为(62.23±0.86)%。结果表明，ISL呈浓度依赖性促使人结直肠癌细胞发生凋亡。

2.3ISL对结直肠癌细胞周期的影响 经ISL干预24 h后，HCT-116和SW480细胞中G1/G0期细胞比例降低(P<0.01),S期细胞比例增加(P<0.05)。结果表明，ISL可以将结直肠癌细胞阻滞在S期，从而抑制细胞生长。见图1。

注：A为不同浓度的ISL干预HCT-116细胞后，细胞在各周期中的分布情况；B为不同浓度的ISL干预SW480细胞后，细胞在各周期中的分布情况；与ISL浓度为0 μmol/L时比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.4ISL对结直肠癌细胞迁移力的影响 对照组的细胞划痕随着时间逐渐变窄，细胞向中间迁移。而经ISL处理后细胞迁移距离较短，划痕间隙较大。结果表明，ISL可显著抑制HCT-116和SW480细胞的迁移。见图2。

注：A为ISL对HCT-116细胞迁移力的影响，B为ISL对SW480细胞迁移力的影响。

2.5ISL对小鼠结直肠癌移植瘤生长的影响 ISL干预后小鼠结直肠癌移植瘤生长缓慢，肿瘤体积较小(P<0.05)，质量减轻(P<0.05)。ISL低浓度组和高浓度组的抑瘤率分别为(22.89±5.09)%和(30.99±3.34)%。HE染色结果显示，ISL高浓度组肿瘤组织坏死区较大，细胞核溶解，细胞轮廓显示不清，血管轮廓被破坏，而阴性对照组中肿瘤细胞分布紧密，未见大片坏死区域。见图3。

注：A为小鼠肿瘤质量在不同浓度ISL作用下的变化；与阴性对照组比较，*P<0.05。B为采用HE染色观察小鼠移植瘤的组织病理改变。

3 讨 论

ISL是从草本类豆科植物甘草中所提取，已发现有器官保护、调节免疫、减轻炎症等作用，属黄酮类化合物[10]。随着对ISL功能活性研究的深入，发现ISL对乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤表现出抗癌潜力。其可通过促使肿瘤细胞凋亡、引发自噬、阻滞细胞周期及抑制新生血管形成等途径，延缓肿瘤的生长及转移[11]。

如在宫颈癌细胞中，ISL可通过内质网应激途径，引发HeLa细胞凋亡[13]。ISL还能通过降低人乳头瘤病毒(HPV)16 E6、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)基因的蛋白表达水平，同时上调Bax的表达，从而发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用[14]。ISL可通过降低乳腺癌PI3K/Akt及NF-kappa B等信号通路的活性，进而抑制乳腺癌肿瘤的生长、转移[15]。在前列腺癌中，ISL可阻滞细胞周期，引发细胞凋亡，降低细胞增殖力，其抗前列腺癌作用可能与活性氧(ROS)水平降低有关[16-18]。

近年来，随着对ISL研究的深入，部分学者发现其在结直肠癌的抗肿瘤活性中具有一定作用，体外研究显示，ISL可抑制结直肠癌细胞HCT-116、SW620细胞增殖及侵袭[19]。给小鼠用ISL灌胃能有效抑制由AOM/DSS诱导的结肠癌的发生[7]。但目前有关ISL抗结直肠癌的作用研究还较少，且缺少体内移植瘤的实验研究。

当受到外界干扰或基因调控异常时，细胞周期进程以及增殖失去控制，进而导致肿瘤的形成。因此，阻滞肿瘤细胞周期进程，抑制其增殖或诱发凋亡，均可有效延缓肿瘤的生长和恶性发展，同时也是评估抗肿瘤药物效果的重要指标。本研究首先通过MTT法检测HCT-116、SW480细胞在梯度浓度ISL作用后的增殖变化，结果显示，随着ISL浓度增加，细胞增殖率明显下降(P<0.05)，表明ISL能抑制结直肠癌细胞的体外增殖，并呈浓度依赖性。同时利用流式细胞术检测ISL对结直肠癌细胞凋亡及周期的影响发现，ISL干预后细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，与细胞增殖实验结果一致。高浓度ISL作用后S期细胞比例增加(P<0.01)，提示ISL具有细胞周期阻滞作用，可将细胞阻滞在S期，从而抑制结直肠癌细胞生长。

结直肠癌为易转移性癌，而癌症转移主要取决于癌细胞的迁移、侵袭能力。因此本研究采用划痕实验检测了ISL对结直肠癌细胞迁移力的影响。结果显示，ISL明显抑制HCT-116及SW480细胞向划痕间隙移动，降低细胞的迁移力。

此外，为进一步明确ISL的体内抗结直肠癌作用，本研究还复制了CT-26结直肠癌荷瘤小鼠模型。结果发现，ISL能明显抑制小鼠移植瘤生长，杀伤肿瘤细胞。

综上所述，本研究表明ISL可促使结直肠癌细胞发生凋亡，细胞周期于S期阻滞以及细胞迁移力下降，并可抑制结直肠癌细胞的体外增殖及小鼠体内移植瘤生长。提示ISL将可能成为结直肠癌的潜在治疗药物，但其抗结直肠癌作用分子机制尚不清楚，需进一步研究。