朱晓燕，姚冬颖，郭 军，郭 治，杨 华，靳 毅

河北省邢台市人民医院：1.肿瘤内二科；2.病理科，河北邢台 054000

结肠癌是消化道常见恶性肿瘤，好发于乙状结肠与直肠交界处。据统计，我国每年新增结直肠癌患者约29.44万例，发病率居所有恶性肿瘤的第3位，高发群体为40～50岁人群，男女发病率之比为2∶1～3∶1，全球每年新增结直肠癌死亡病例约14.23万例，病死率居所有恶性肿瘤的第5位，且近年来结肠癌发病率和病死率呈现上升趋势[1-2]。早发现、早治疗是提升结肠癌预后的关键，因此探索结直肠癌发病机制对早期诊治、延长生存期具有重要价值。蛋白精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)是一种染色质修饰酶，在细胞增殖、分化、凋亡等细胞生物学行为及信号转导方面具有重要作用[3]。环状蛋白精氨酸甲基转移酶5(circPRMT5)具有稳定的闭环结构，能够调控表观遗传和细胞生物学行为[4]。既往研究显示，膀胱尿路上皮癌、前列腺癌等恶性肿瘤发生及发展与circPRMT5异常表达有关[5]，但circPRMT5与结肠癌的关系仍处于探索阶段。因此本研究就circPRMT5在结肠癌患者中的表达及其对生物学性质的影响进行了分析，以期为临床防治结肠癌提供参考依据，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年10月至2019年10月本院收治的93例结肠癌患者为研究对象，收集其手术切除的结肠癌组织及癌旁正常组织，其中男58例，女35例；年龄20～80岁，平均(52.26±5.34)岁。纳入标准：(1)结肠癌经病理活检确诊[1]；(2)入院前未接受任何抗结肠癌治疗；(3)依从性好，能配合完成本研究；(4)签订知情同意书。排除标准：(1)病历资料不齐全；(2)心、肝、肾、肺、脑等重要脏器功能不全；(3)合并其他胃肠道疾病、其他恶性肿瘤、过敏性疾病、自身免疫系统疾病、感染性疾病、传染性疾病、精神系统疾病、血液系统疾病；(4)哺乳期或妊娠期女性。本研究上报本院医学伦理委员会并获得批准。

1.2方法 (1)采用免疫印迹法(Western blot)检测结肠癌组织及癌旁正常组织中circPRMT5蛋白表达量。取结肠癌患者癌组织及癌旁正常组织，剪碎后置于玻璃匀浆器(北京凯瑞基生物科技有限公司)，加入RIPA裂解液(北京百泰克生物技术有限公司)，匀浆，采用细胞离心机(北京鼎昊源科技有限公司，型号：CellSmart)，以13 000 r/min离心15 min，取上清液，使用BCA试剂盒(上海榕柏生物技术有限公司)测定蛋白浓度，对蛋白定量，取总蛋白上样于10%的SDS-PAGE凝胶(北京绿源伯德生物科技有限公司)中，进行电泳、切胶、转膜，5%脱脂奶粉封闭液(上海联硕宝为生物科技有限公司)封闭，加入1∶200稀释的兔抗circPRMT5单克隆抗体(上海晅科生物科技有限公司)、1∶500稀释的兔抗GAPDH单克隆抗体(北京博尔西科技有限公司)，4 ℃孵育过夜，TBST溶液(武汉爱博泰克生物科技有限公司)洗膜，加入1∶4 000稀释的HRP标记山羊抗兔IgG二抗(北京泰泽嘉业科技发展有限公司)，37 ℃孵育60 min，TBST溶液洗膜，采用ECL发光试剂盒(上海锐赛生物技术有限公司)显色，洗片后显影、定影，应用Image Quant TL软件(北京碧橙蓝生物科技有限责任公司)进行分析，GAPDH为内参蛋白，以circPRMT5灰度值与GAPDH灰度值之比表示circPRMT5蛋白表达量。(2)细胞培养、分组及干预。将人结肠癌SW480细胞(上海圻明生物科技有限公司)分为空白对照组、阴性对照组、试验组，进行原代培养，待细胞融合度达80%时，消化、传代，取对数生长期的SW480细胞接种于6孔细胞培养板，细胞接种密度为5×106个/孔，用含10%胎牛血清的DMEM培养基(上海信裕生物科技有限公司)，于37 ℃、5%的CO2培养箱(北京博劢行仪器有限公司)中培养，待细胞融合度达90%时，空白对照组不作任何处理，阴性对照组转染10 μg pEGFP-N1质粒(武汉淼灵生物科技有限公司)，试验组转染10 μg pEGFP-N1-circPRMT5质粒(上海汉恒生物公司)，转染结束继续培养48 h。所有转染操作按照北京嘉美臻元生物技术有限公司的LipofectamineTM2000转染说明书进行。(3)采用Western blot检测各组SW480细胞中circPRMT5蛋白表达量，操作同上。(4)采用CCK-8法检测各组SW480细胞增殖能力。取转染后的各组SW480细胞接种于6孔细胞培养板中，细胞接种密度为2×103个/孔，每孔加入100 μL细胞悬液和10 μL CCK-8溶液(上海富衡生物科技有限公司)，于37 ℃、5% CO2培养箱培养2 h，采用酶标仪(苏州亚凡生物技术有限公司，型号：M2e)测定550 nm波长下各孔吸光度值，计算SW480细胞增殖率=(处理组吸光度值/空白对照组吸光度值)×100%。(5)采用Transwell小室侵袭试验检测各组SW480细胞侵袭能力：取转染后的各组SW480细胞制成细胞悬液，在Transwell小室的上室铺入基质胶(上海惠研生物科技有限公司)，每孔60 μL，然后加入细胞悬液，每孔200 μL，在Transwell小室的下室加入600 μL DMEM培养液，于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h，24 h后弃上室液体，4%多聚甲醛溶液(北京索莱宝科技有限公司)固定细胞，风干，0.1%结晶紫(青岛达斐生物科技有限公司)染色，PBS溶液(苏州瑞诺德生物科技有限公司)漂洗，于荧光显微镜(南京新惠通生物科技有限公司，型号：Revole)下观察并计算穿过小室膜的平均细胞数，以此判定SW480细胞侵袭能力。(6)采用流式细胞术检测各组SW480细胞凋亡率。取转染后的各组SW480细胞制成细胞悬液，用1 mol/L×Tris Buffer缓冲液(上海高创化学科技有限公司)洗涤，经0.25%胰蛋白酶(上海北诺生物科技有限公司)消化，制备细胞悬液，结合1 mol/L×Tris Buffer缓冲液重悬细胞，于流式管中依次加入300 μL细胞悬液、5 μL异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC，武汉益普生物科技有限公司)避光反应15 min，再加入200 μL 1 mol/L×Tris Buffer缓冲液及5 μL碘化丙啶(PI)染液(上海继锦化学科技有限公司)，混匀，1 h内使用流式细胞仪(深圳市达科为生物技术股份有限公司，型号：EXFLOW-206)检测SW480细胞凋亡率。所有试验重复3次。

2 结 果

2.1结肠癌组织及癌旁正常组织中circPRMT5蛋白表达量 结肠癌组织中circPRMT5蛋白表达量(2.79±1.23)显著高于癌旁正常组织(0.58±0.12)，差异有统计学意义(t=12.197，P<0.05)。见图1。

注：A为癌旁正常组织，B为结肠癌组织；GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

2.2各组SW480细胞增殖率的比较 试验组SW480细胞增殖率(88.83%±5.19%)显著高于空白对照组(53.48%±3.77%)、阴性对照组(53.32%±3.90%)，差异有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组SW480细胞增殖率与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3各组SW480细胞侵袭能力 试验组SW480细胞穿过小室膜的细胞数[(37.24±5.92)个]显著高于空白对照组[(13.38±2.64)个]、阴性对照组[(13.52±2.53)个]，差异有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组SW480细胞穿过小室膜的细胞数与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2 各组SW480细胞侵袭能力

2.4各组SW480细胞凋亡率的比较 试验组SW480细胞凋亡率(7.77%±2.25%)显著低于空白对照组(15.51%±3.83%)、阴性对照组(15.28%±3.87%)，差异有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组SW480细胞凋亡率与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5各组SW480细胞中circPRMT5蛋白表达量 试验组SW480细胞中circPRMT5蛋白表达量(2.95±1.18)显著高于空白对照组(1.78±0.53)、阴性对照组(1.81±0.49)，差异有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组SW480细胞凋亡率与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

注：GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

3 讨 论

结肠癌是指结肠黏膜上皮在多种致癌因素作用下导致的恶性病变，早期通常表现为腹胀、消化不良、排便习惯异常变化、腹泻与便秘交替等不具备特异性的症状，随着疾病不断发展，癌细胞可转移至淋巴结、肺、骨、肝、脑等组织脏器，出现淋巴结肿大、肺水肿、肠梗阻、腹部肿块、腹腔积液等转移表现，危害极大[6]。随着人们生活水平提高，饮食结构变化，生活习惯改变，结肠癌发病率逐年增加，对人类生命安全造成严重威胁[7]。临床目前治疗结肠癌主要采用手术、放射性治疗、化学药物治疗等相结合的综合性治疗方案，能够缓解临床症状，缩小原发癌灶，减缓肿瘤发展速度，降低复发率，但手术无法彻底切除癌组织，癌细胞易扩散转移，患者往往预后不良[8]。因此探索结肠癌发病机制成为临床的研究热点。

结肠癌发病是一个多因素、多步骤、多途径的复杂过程，除家族史、溃疡性结肠炎、高脂饮食、结肠息肉、低纤维素饮食等因素外，也涉及分子遗传学改变[9]。随着分子生物学理论不断完善、实验技术的迅速发展、基因学的深入研究，分子生物标志物成为恶性肿瘤研究的热点，且被应用于恶性肿瘤早期诊断、疗效监测、预后判断。PRMT5是一种Ⅱ型蛋白质精氨酸甲基转移酶，广泛表达于哺乳动物细胞中，能催化甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移到精氨酸蛋白的残基上，并在细胞增殖、分化、凋亡等细胞生物学行为以及信号转导方面具有重要作用[10]。PRMT5在结肠癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、皮肤癌、乳腺癌、子宫颈癌、膀胱癌等恶性肿瘤中过表达，过表达的PRMT5可通过调节细胞周期蛋白、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路等调控肿瘤基因表达，影响肿瘤细胞生物学行为，进而影响肿瘤发生及发展[11]。circPRMT5具有稳定的闭环结构，能够参与染色质重塑、基因转录、RNA代谢、高尔基体结构维持、调控细胞增殖及分化等，是具有一定前景的临床分子标志物。有研究发现，circPRMT5在前列腺癌患者外周血中呈高表达状态，能够促进前列腺癌细胞上皮间质转化(EMT)[12]。另有研究发现，circPRMT5在结直肠癌患者癌组织中亦呈高表达[13]，本研究结果与此报道结果一致，提示circPRMT5高表达可能与结肠癌发病有关。本研究显示，试验组SW480细胞增殖率、侵袭能力、circPRMT5蛋白表达量显著高于空白对照组、阴性对照组(P<0.05)，试验组SW480细胞凋亡率显著低于空白对照组、阴性对照组(P<0.05)，提示circPRMT5高表达能够促进结肠癌细胞增殖、侵袭，抑制结肠癌细胞凋亡，这与JING等[14]和ZHU等[15]的研究结果相符，JING等[14]研究显示circPRMT5表达水平与结肠癌患者肿瘤最大径、临床分期、淋巴结转移、浸润程度呈正相关；ZHU等[15]研究显示沉默circPRMT5表达能够促进结肠癌细胞凋亡并诱导线粒体膜电位(MMP)下降。分析其原因，circPRMT5高表达可能通过激活锌指转录因子介导的EMT，从而促进结肠癌细胞增殖、侵袭，抑制结肠癌细胞凋亡，使结肠癌恶性程度更高。

综上所述，circPRMT5在结肠癌患者中呈高表达，circPRMT5高表达能够促进结肠癌细胞增殖、侵袭，抑制结肠癌细胞凋亡。但由于本研究受到试验条件、仪器精度、研究时间、纳入病例数等因素限制，故此结论仍有待进一步证实。