张 巍，房健健，柴巧英，陈会校

河北省邯郸市第一医院：1.心内四科；2.重症医学科，河北邯郸 056000

随我国经济高速发展，心血管疾病发病的危险因素普遍暴露，其发病率、病死率也随之急剧增加，而急性心肌梗死(AMI)则为引起患者死亡的主要原因之一，因此预防和治疗AMI是防治冠心病的重点[1-2]。AMI后梗死相关的血管再通、动脉血管重建，使心肌恢复有效再灌注是治疗AMI的关键所在。经皮冠状动脉介入治疗(PCI)是急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)的主要治疗手段，在临床上得到广泛应用和认可，约有75%的STEMI患者行PCI手术后冠状动脉血流可恢复正常[3-4]。但是部分患者出现心肌灌注不足、冠状动脉无复流现象，导致患者治疗结果不理想，预后差。因此探讨无复流现象的发生机制，对预防和治疗PCI术后冠状动脉无复流十分重要。微小RNA(miRNA)属于非编码单链RNA，与靶信使RNA(mRNA)3′端完全或部分结合使靶mRNA降解或翻译抑制，从而调控基因表达，进而参与细胞增殖、分化、凋亡等多种病理生理进程[5-6]。有研究显示，微小RNA-34a(miR-34a)在AMI大鼠心肌细胞中高表达，能够诱导心肌细胞凋亡[7]。沉默信息调节因子1(SIRT1)是miR-34a的靶基因之一，能够保护细胞，减少细胞凋亡[8]。PCI术后无复流患者外周血中miR-34a、SIRT1 mRNA表达水平的相关报道较少，因此本研究拟测定PCI术后无复流患者外周血中miR-34a、SIRT1 mRNA表达水平，分析两种标志物与冠状动脉复流情况的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年6月至2020年4月本院收治的106例首次因STEMI行PCI术的患者为研究对象(STEMI患者组)，其中男61例，女45例；年龄35～79岁，平均(58.29±2.16)岁，均符合STEMI诊断标准[9]。纳入标准：(1)首次发病的STEMI患者；(2)发病12 h内行PCI术；(3)胸痛≥30 min；(4)心电图至少2个导联ST段抬高≥2 mm；(5)肌酸激酶同工酶(CK-MB)增高两倍以上；(6)患者资料无缺失。排除标准：(1)缺血性心肌病、陈旧性心肌梗死、左主干病变患者；(2)肝肾功能不全者；(3)多支血管疾病患者；(4)血流动力学指标异常的心律失常患者；(5)冠状动脉严重扭曲病变或钙化患者。另选取同期体检健康志愿者124例作为对照组，其中男70例，女54例；年龄33～79岁，平均(59.09±3.72)岁。两组受试者在年龄、性别、有无吸烟史方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。本研究经邯郸市第一医院伦理委员会批准，且受试者均知晓、签订临床试验知情同意书。

表1 两组受试者一般临床资料比较

1.2方法

1.2.1血清标本采集 清晨抽取STEMI患者PCI术后和健康志愿者体检时空腹静脉血6 mL，静置20 min，待血液凝固后，置于高速离心机中，温度25 ℃，5 000 r/min离心20 min，离心半径15 cm，血清放入-20 ℃冰箱中待用。

1.2.2血清生化指标检测 采用全自动生化分析仪(型号：BK-800，济南欧莱博科学仪器有限公司)分析PCI术后血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平等生化指标。

1.2.3实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测血清中miR-34a、SIRT1 mRNA表达水平 采用Trizol试剂盒(批号：A7646-83，上海江莱生物科技有限公司)提取血清中总RNA，并检测其纯度；采用逆转录试剂盒[批号：RA639505，宝日医生物技术(北京)有限公司]将RNA逆转录为cDNA。RT-qPCR试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司(批号：SK2491-20)。miR-34a、SIRT1 mRNA及内参U6引物序列由上海启因生物科技有限公司合成。miR-34a的上游引物序列：5′-ATG GTT CGT GGG TGG CAG TGT CTT AGC TGG-3′；下游引物序列：5′-GCA GGG TCC GAG GTA TTC-3′。SIRT1 mRNA上游引物序列：5′-GGA GGA GCT GGA TTT GGG ACT GAT-3′；下游引物序列：5′-GGT GGA ACA ATT CCT GTA CCT GCA CA-3′。内参U6上游引物序列：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；下游引物序列：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。相关反应在PCR扩增仪(型号：L9700C，常州德杜精密仪器有限公司)中进行。扩增条件：95 ℃ 5 min，59 ℃ 30 s，40个循环后，溶解曲线温度61～95 ℃，读数1次/分钟。反应结束后，记录PCR仪上的扩增曲线的Ct值，根据公式：2-ΔΔCt=[ΔΔCt=(Ct试验组目的基因-Ct试验组内参)/(Ct对照组目的基因-Ct对照组内参)]，分析miR-34a、SIRT1 mRNA的相对表达量。

1.3PCI术后无复流的判断 冠心病冠状动脉造影TIMI分级[10]：(1)无血流灌注或闭塞血管远端无血流记为0级；(2)造影剂可以部分通过，冠状动脉狭窄的远端无法完全充盈记为Ⅰ级；(3)造影剂能完全充盈冠状动脉远端，但造影剂进入和清除的速度较正常的冠状动脉慢记为Ⅱ级；(4)冠状动脉远端可以迅速充盈与消除，与正常冠状动脉相同记为Ⅲ级。根据TIMI分级，当TIMI≤Ⅰ级时，定义为无复流，判断时应排除冠状动脉夹层、高度残余狭窄或冠状动脉痉挛、急性血栓形成。根据判断将AMI患者进行分类，其中无复流患者44例(无复流组)，再灌注患者62例(再灌注组)。

2 结 果

2.13组受试者血清生化指标比较 与对照组相比，无复流组、再灌注组血清TG、TC、LDL-C水平显著升高(P<0.05)，无复流组显著高于再灌注组(P<0.05)。3组血清HDL-C、BUN、Cr水平两两比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3组受试者血清生化指标比较

2.23组受试者血清中miR-34a、SIRT1 mRNA表达水平的比较 与对照组相比，无复流组、再灌注组血清miR-34a表达水平显著升高，SIRT1 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)，无复流组miR-34a表达水平显著高于再灌注组，SIRT1 mRNA表达水平显著低于再灌注组(P<0.05)。见表3。

表3 3组受试者血清中miR-34a、SIRT1 mRNA表达水平的比较

2.3PCI术后患者血清中miR-34a、SIRT1 mRNA表达水平相关性分析 Pearson相关分析结果表明，PCI术后患者血清中miR-34a和SIRT1 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.578，P<0.05)。

2.4影响PCI术后冠状动脉无复流的多因素Logistic回归分析 多因素Logistic回归分析表明，miR-34a表达水平升高、SIRT1 mRNA表达水平降低是PCI术后冠状动脉无复流的危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响PCI术后冠状动脉无复流的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

目前PCI术后冠状动脉无复流的病理机制主要包括：行PCI术时动脉粥样硬化斑块脱落活化组织因子、PCI术脱落碎片栓塞、心肌细胞内及间质水肿、微血管痉挛、白细胞聚集、微血栓形成、氧自由基介导的内皮细胞缺血损伤等[11-12]。临床上早期诊断无复流、PCI术中置入远端保护装置、术前或术后辅以药物干预等方式使PCI术后冠状动脉无复流的防治取得了一定的成效，但STEMI患者PCI术后的微循环再灌注评价指标及预后的相关危险因素尚未明确，需要进一步研究。

AMI患者PCI术后冠状动脉无复流现象受机体多种信号通路调控，因此研究PCI术后冠状动脉无复流的相关调控通路，对PCI术后冠状动脉无复流防治十分关键。本研究通过检测受试者血清生化指标发现，与对照组、再灌注组相比，无复流组血清TG、TC、LDL-C水平显著升高，再灌注组高于对照组(P<0.05)，说明TG、TC、LDL-C水平与PCI术后冠状动脉无复流相关，无复流现象可能会导致TG、TC、LDL-C水平升高。miR-34a与AMI发生发展相关，研究发现，当归补血汤能够下调miR-34a表达水平，上调SIRT1水平，以提高小鼠左室射血分数，减少心肌细胞凋亡和纤维化，抑制心肌梗死后心室重塑[13]。另有研究发现，miR-34a表达水平在冠状动脉粥样硬化组至急性心肌梗死组呈逐渐升高趋势，提示miR-34a参与冠状动脉病变的发生发展进程，与病变程度呈正相关[14]。随后有研究证实尿毒素硫酸吲哚酚可能通过miR-34a、NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体促进慢性肾功能不全心肌损伤[15]。本研究发现，与对照组、再灌注组相比，无复流组血清miR-34a表达水平显著升高，再灌注组高于对照组，提示miR-34a表达水平升高可能参与PCI术后冠状动脉无复流进程，导致无复流发生。

SIRT1主要分布在细胞核，参与细胞分化、增殖、衰老等生理过程，最新研究发现，SIRT1在调节心肌细胞凋亡进程中发挥重要作用，能量限制能够通过AMPK信号通路上调SIRT1水平，进而保护心肌细胞免受缺血/再灌注损伤[16]。胡明珠等[17]研究发现，硫化氢(H2S)可能通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路，上调SIRT1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)水平，减小心肌梗死面积，保护大鼠缺血心肌细胞。FU等[18]研究表明，miR-34a过表达可明显增加心肌细胞凋亡、梗死面积，左心室功能也随之降低，进而使心肌损伤明显加重，而miR-34a水平抑制，SIRT1受miR-34a负调控，下游基因乙酰化p53(ac-p53)、B细胞淋巴瘤因子-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达也发生相应的变化，心肌损伤有所缓解，提示miR-34a抑制疗法可能成为心肌缺血再灌注损伤新的治疗方法。本研究发现，与对照组、再灌注组相比，无复流组血清SIRT1 mRNA表达水平显著降低，再灌注组低于对照组(P<0.05)，提示SIRT1高表达可能有助于再灌注，缓解PCI术后冠状动脉无复流。进一步分析发现，PCI术后患者血清中miR-34a和SIRT1 mRNA表达水平呈负相关，说明miR-34a可能通过负调控SIRT1 mRNA表达参与PCI术后冠状动脉无复流。多因素Logistic回归分析表明，miR-34a表达水平升高、SIRT1 mRNA表达水平降低是PCI术后冠状动脉无复流的危险因素，提示miR-34a高表达、SIRT1低表达可能导致无复流发生，这类患者需要特别重视。

综上所述，在PCI术后冠状动脉无复流患者血清中，miR-34a高表达、SIRT1低表达可能诱导无复流发生，但是具体调控机制还有待深入研究。