贾 维，栾鹏飞，马占兵，彭 亮，钟慧军，朱永生，党 洁△

1.宁夏医科大学基础医学院，宁夏银川 750004；2.宁夏回族自治区生育力保持教育部重点实验室，宁夏银川 750004；3.西安交通大学医学部法医学院法医物证系，陕西西安 710061

海洛因依赖是一种在吸食海洛因后所引发的复杂的慢性复发性脑病，以强迫性觅药、药物滥用、机体对药物产生强烈精神和身体依赖性为主要特征[1-2]。研究显示，遗传因素在海洛因依赖的发生中作用较大[3-4]。与其他成瘾药物的特征一致，服用海洛因后会引起大脑伏隔核区域多巴胺神经元末梢大量释放多巴胺，从而引起药物的奖赏效应，这是造成药物成瘾、复发及强迫性觅药等依赖行为的基础[3，5]。2015年的一项全基因组关联分析(GWAS)研究显示，结肠癌缺失基因(DCC)、非典型钙黏蛋白3基因(FAT3)、成虫大盘基因同源物2(DLG2)和驱动结合蛋白1基因(KTN1)多态性与人类大脑皮层下结构及中脑边缘腹侧区的活动相关，可能参与了中脑边缘奖赏效应的调节[3]。为进一步明确以上4个基因单核苷酸多态性(SNP)与海洛因依赖的关联性，本研究通过SNaPshot SNP分型技术比较分析DCC(rs2270954)、FAT3(rs1318862)、DLG2(rs683250)和KTN1(rs945270)位点基因型及等位基因型在海洛因依赖患者与健康者间的分布差异及其基因间交互作用，以期为海洛因依赖人群易感基因的筛选和靶向治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2012年3月至2017年7月在西安市精神卫生中心接受美沙酮维持治疗的396例汉族男性海洛因依赖患者为海洛因依赖组，平均年龄(47.03±5.95)岁，均无亲缘关系，患者均符合《美国精神障碍诊断和统计手册(第4版)》阿片类药物依赖性表现的诊断标准。所有患者均无肢体残疾，且无其他精神疾病。排除标准：有酒精、烟草、安非他命、巴比妥酸盐、苯二氮卓类药物或大麻依赖史的患者；同时服用其他可能影响中枢神经系统的处方药的患者；有癫痫发作史、血液系统疾病或严重的肝肾损害史等情况的患者。选择西安交通大学第一附属医院体检中心接受健康检查的401例健康汉族男性作为健康对照组，平均年龄(46.41±9.59)岁，均无阿片类等非法成瘾药物服用史，无精神、神经类疾病及其他内科疾病史。本研究通过西安交通大学医学部伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本采集及DNA提取 利用全血细胞DNA提取试剂盒EZNATMBlood DNA Midi(Omega Bio-Tek，Norcross，GA，USA)提取标本中DNA。收集各研究对象全血2 mL加入150 μL OB蛋白酶，2.1 mL BL Buffer和20 μL RNase A，高速涡旋混匀1 min，65 ℃水浴15 min后加入2.2 mL无水乙醇。将DNA Midi结合柱套在15 mL收集管中，将上述混合液转移至DNA Midi结合柱中以4 000×g离心5 min后加入3 mL HB Buffer再次离心。随后DNA Wash Buffer清洗DNA后，利用预热的1.5 mL Elution Buffer洗脱DNA至新的1.5 mL无酶EP管中，-20 ℃保存。

1.2.2SNP筛选 通过Haploview 4.2软件对4个基因的标签SNPs进行筛选，r2≥0.8；最小等位基因频率(MAF)>0.05，见表1。

表1 DCC、FAT3、DLG2、KTN1基因SNP位点相关信息

1.2.3基因分型 使用SNaPshot SNP分型技术对DCC、FAT3、DLG2和KNT1基因的4个SNP进行基因分型。(1)双蒸水稀释标本DNA至5 ng/μL，加入1 U HotStarTaq聚合酶(Qiagen Inc.，USA)扩增目标SNP所在片段，总体积5 μL，PCR反应条件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共45个循环；最终72 ℃ 30 s。(2)碱性磷酸酶去除剩余dNTP。(3)针对SNP的单碱基延伸反应：反应体系为0.755 μL无酶水、0.2 μL 10×iPLEX缓冲液、0.2 μL终止混合物、0.041 μL iPLEX酶(Sequenom)，0.804 μL 10 μmol的延伸引物；反应条件为94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，共40个循环；最后72 ℃ 3 min。(4)终止反应物中加入6 mg阳离子交换树脂(Sequenom)脱盐，使用MassARRAY Nanodispenser(Sequenom)将最终的分型产物点样到一块384孔的spectroCHIP(Sequenom)上，并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)进行分析。(5)最终结果由MassARRAY RT软件系统(版本号3.0.0.4)实时读取，并由MassARRAY Typer软件系统(版本号3.4)完成基因分型分析。(6)随机抽取5%的标本(55例受试者)进行二次基因分型，重复率100%，提示分型结果可信。

1.3统计学处理 采用SPSS22.0建立本地数据库，采用在线SNP分析软件包SNPStats(https://www.snpstats.net/)统计分析。基因型、等位基因频率与Hardy-Weinberg平衡的符合程度采用Pearsonχ2检验，相对危险度采用比值比(OR)和95%可信区间(95%CI)确定。基因交互分析采用多维因子降维法(MDR，http://sourceforge.net/projects/mdr/)及二元Logistic回归法，选取双侧检验进行计算，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1Hardy-Weinberg平衡分析 海洛因依赖组和健康对照组间4个SNP位点基因型与等位基因型频率分布差异无统计学意义(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg平衡定律，说明研究对象来自同一群体，具有良好的代表性。

2.2基因分型 海洛因依赖组和健康对照组经过年龄校正后，DCC(rs2270954)、FAT3(rs1318862)、DLG2(rs683250)和KNT1(rs945270)位点基因型及等位基因频率结果见表2。 结果显示，DCC(rs2270954)及KNT1(rs945270)位点的等位基因和基因型频率在两组间差异有统计学意义(P<0.05)。海洛因依赖组DCC(rs2270954)的C等位基因频率(P=0.005，OR=0.723，95%CI：0.576～0.908)和KNT1(rs945270)的G等位基因频率(P=0.004，OR=0.698，95%CI：0.547～0.891)相较于健康对照组显著降低，提示其可能是海洛因依赖的保护性因素，而携带DCC(rs2270954)的A等位基因及KNT1(rs945270)的C等位基因的个体发生海洛因依赖的可能性更高。此外，在本研究中FAT3(rs1318862)和DLG2(rs683250)位点的等位基因和基因型频率在海洛因依赖组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)，提示其与海洛因依赖发病风险增高并无关联。

表2 4个SNP基因型和等位基因频率在两组间的比较[n(%)]

2.3基因交互分析 利用二元Logistic回归及MDR，本研究分析了4个SNP的基因交互作用。通过MDR分析4个SNP间潜在的高维交互作用，通过交叉验证一致性及检验精确度进行确认。以是否有海洛因依赖(对照=0，病例=1)为因变量，以4个SNP作为自变量进行赋值(0=0个风险等位基因，1=1个风险等位基因，2=2个风险等位基因)。DCC(rs2270954)位点为一阶最优模型(P<0.05)；DCC(rs2270954)与KTN1(rs945270)为二阶最优模型(P<0.000 1)；DCC(rs2270954)、DLG2(rs683250)和KTN1(rs945270)的组合为三阶最优模型(P<0.000 1)，此外本研究发现4个SNP间在四阶水平的交互同样有统计学意义(P<0.000 1)。所有模型均经过1 000次置换检验，见表3。

表3 MDR检测4个SNP位点基因间交互作用

同时，利用二元Logistic回归分析4个SNP位点间在二阶、三阶和四阶水平的相乘交互作用，见表4。在构成的11种交互作用模型中，DCC(rs2270954)×KTN1(rs945270)(P<0.01)为仅有的在二阶模型中存在显著相乘交互作用的组合。此外，在4种三阶交互模型中，有3种组合在健康对照组和海洛因依赖组间存在显著交互作用，其中DCC(rs2270954)×DLG2(rs683250)× KTN1(rs945270)组合的显著交互作用在MDR结果中得到验证。本研究并未发现四阶交互作用。

表4 二元Logistic回归法检测4个SNP位点基因间交互作用

3 讨 论

药物依赖被认为是成瘾药物通过影响中脑边缘多巴胺系统，也就是大脑中枢奖赏活动区域过度释放多巴胺，刺激大脑中枢系统产生愉悦感而引发的，因此能够参与中脑边缘奖赏效应调节的基因都是潜在的药物成瘾易感基因[5]。

有研究发现，DCC、FAT3、DLG2及KTN1基因多态性与人类大脑皮层下结构及中脑边缘腹侧区的活动相关，可能参与了中脑边缘奖赏效应的调节，且DCC基因rs16956878、rs12607853和rs2292043与海洛因依赖的发生密切相关，可能是调控海洛因依赖发生的关键效应分子[6]，而其他几个基因与海洛因依赖的关联性目前尚未见报道。本研究结果显示，DCC(rs2270954)位点的等位基因和基因型频率在健康对照组和海洛因依赖组之间差异有统计学意义(P<0.05)，携带DCC(rs2270954)A等位基因的个体可能对海洛因依赖更为易感，进一步说明DCC可能是引起海洛因依赖风险增高的潜在易感基因。

DCC基因定位于18q21.3，是中脑边缘皮质多巴胺系统的重要组成部分与功能决定因素[7]。作为神经生长因子Netrin-1的受体，DCC参与了Netrin-1依赖性联合神经元轴突的生长[8-10]，在突触可塑性、轴突引导、昼夜节律维持等方面发挥作用[11-12]。DCC(rs2270954)位点位于DCC基因3′非编码区，有研究显示，该位点与精神分裂症的发生密切相关，推测其可能通过影响DCC mRNA与特定microRNA的靶向结合，改变DCC蛋白质稳定性或mRNA的翻译，从而调控DCC基因的表达水平[13]。本研究结果显示，携带DCC(rs2270954)A等位基因的个体更易于对海洛因等成瘾药物产生依赖，这可能是由于该位点的变异影响DCC的表达，从而影响大脑中枢活动区域多巴胺能神经元突触的可塑性所致。

KTN1基因定位于14q22.1，其编码的KTN1作为驱动结合蛋白，能够通过与驱动蛋白相结合参与细胞内囊泡的转运及膜形态与结构的维持[14]。本研究发现KTN1(rs945270)位点的C等位基因频率与海洛因依赖的发病风险具有一定关系。rs945270位点属于基因间SNP，有研究显示，该位点C等位基因能够显著促进KTN1的表达，从而通过增加大脑壳核灰质体积促进中脑多巴胺能神经元释放多巴胺[15]。

DCC(rs2270954)和KNT1(rs945270)位点除了基因型与等位基因频率在海洛因依赖组和对照组间差异有统计学意义(P<0.05)外，通过基因交互分析发现，二者对海洛因依赖的发病风险还存在统计学意义的交互作用，提示二者可能通过相互作用影响DCC和KTN1的表达，继而异常调节中脑边缘多巴胺系统，增加海洛因依赖的发病风险。

FAT3属于非典型钙黏蛋白家族，是一种钙离子依赖性黏附蛋白[16]。研究显示，FAT3的异常表达能影响大脑尾壳核体积的大小，从而在个体行为动作、习惯养成和药物依赖等方面发挥重要调节作用[6]。DLG2是突触后致密结构的支架蛋白，而突触后致密结构已被证实与海洛因依赖相关[12]。然而，本研究并未发现FAT3(rs1318862)和DLG2(rs683250)位点与海洛因依赖之间存在相关性。虽然FAT3(rs1318862)、DLG2(rs683250)并不是海洛因依赖的独立危险因子，但是其可能通过与DCC(rs2270954)和KNT1(rs945270)的交互作用，参与海洛因依赖的发生。

本研究尚存在很多不足。作为一类受环境、人种等差异影响的高度异质性多基因遗传病，仅在单一人群建立个别位点与海洛因依赖间的关联性远远不够，因此有必要在将来进一步扩大研究群体，加大SNP位点数量后全面研究基因多态性与海洛因依赖的关联性，同时进一步通过交互分析研究海洛因依赖与家庭环境、亲人态度、个体人格特征等环境风险因子间的交互作用。

综上所述，本文研究了DCC(rs2270954)、FAT3(rs1318862)、DLG2(rs683250)和KNT1(rs945270)位点SNP与海洛因依赖的关联，结果显示DCC(rs2270954)及KTN1(rs945270)位点SNP可能与海洛因成瘾有关，且二者可能通过交互作用影响大脑奖赏效应的调节。本研究将为海洛因依赖人群易感基因的筛选和靶向治疗提供一定理论依据。