郭烨 马庆云 赵文丽 段风

1. 100190，北京市中关村医院口腔科； 2. 陕西中医药大学第二附属医院口腔科；3. 西安医学院第三附属医院口腔科

生长阻滞特异性转录因子5(growth arrest-special transcript 5，GAS5)是一个与牙周病有关的lncRNA，被报道在牙周炎患者中表达降低[1]。GAS5在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中GAS5表达上调且发挥着促进成骨分化的作用[2]，然而其是否参与人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化并不清楚。本研究旨在观察GAS5在hPDLSCs成骨诱导前后的表达变化，并分析靶向干扰其表达对hPDLSCs成骨分化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 基本材料

hPDLSCs(上海联迈); DMEM完全培养基(深圳百恩维); GAS5-siRNA及阴性对照NC-siRNA(上海吉玛); miR-222-3p模拟物、miR-222-3p抑制剂antimiR-222-3p(百奥迈科生物); 脂质体3000、Trizol试剂、茜素红和双荧光素酶报告基因检测试剂盒(北京索莱宝)； psiCHENK2载体质粒(上海柯雷)；倒置显微镜(OLYMPUS，日本); CO2培养箱(上海博迅)； RT-PCR仪(Bio-Rad，美国)。

1.2 细胞培养与诱导分化

采用DMEM完全培养基在湿度饱和、37 ℃和5% CO2常规条件的培养箱内常规培养hPDLSCs；待贴壁生长至90%密度时，加入0.25%胰蛋白酶消化，并按照1 ∶4比例传代。将第3代hPDLSCs接种至6孔板上，培养至80%汇合度时，将细胞分为对照组和诱导组，对照组细胞不做处理，而诱导组细胞以含10 nmol/L地塞米松、0.05 mmol/L维生素C和10 mmol/L β-甘油磷酸钠的成骨诱导液培养。3 d换液/次，待培养14 d后采用RT-PCR检测GAS5、Runx2、ALP和OCN表达。

1.3 细胞转染

实验分为： (1)未转染组：正常培养； (2)NC-siRNA组：转染NC-siRNA； (3)GAS5-siRNA组：转染GAS5-siRNA； (4)GAS5-siRNA+antimiR-NC组：共转染GAS5-siRNA和antimiR-NC；GAS5-siRNA+antimiR-222-3p组：共转染GAS5-siRNA和antimiR-222-3p，其中，每组设3 个复孔。将hPDLSCs接种至6 孔板，培养至70%汇合度时，按照脂质体3000说明书对hPDLSCs进行瞬时转染；转染6 h后换液，培养48 h收集各组细胞，RT-PCR检测GAS5和miR-223-3p表达水平评价转染效率后，再以成骨诱导液培养。……