郭烨 马庆云 赵文丽 段风

1. 100190，北京市中关村医院口腔科； 2. 陕西中医药大学第二附属医院口腔科；3. 西安医学院第三附属医院口腔科

生长阻滞特异性转录因子5(growth arrest-special transcript 5，GAS5)是一个与牙周病有关的lncRNA，被报道在牙周炎患者中表达降低[1]。GAS5在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中GAS5表达上调且发挥着促进成骨分化的作用[2]，然而其是否参与人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化并不清楚。本研究旨在观察GAS5在hPDLSCs成骨诱导前后的表达变化，并分析靶向干扰其表达对hPDLSCs成骨分化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 基本材料

hPDLSCs(上海联迈); DMEM完全培养基(深圳百恩维); GAS5-siRNA及阴性对照NC-siRNA(上海吉玛); miR-222-3p模拟物、miR-222-3p抑制剂antimiR-222-3p(百奥迈科生物); 脂质体3000、Trizol试剂、茜素红和双荧光素酶报告基因检测试剂盒(北京索莱宝)； psiCHENK2载体质粒(上海柯雷)；倒置显微镜(OLYMPUS，日本); CO2培养箱(上海博迅)； RT-PCR仪(Bio-Rad，美国)。

1.2 细胞培养与诱导分化

采用DMEM完全培养基在湿度饱和、37 ℃和5% CO2常规条件的培养箱内常规培养hPDLSCs；待贴壁生长至90%密度时，加入0.25%胰蛋白酶消化，并按照1 ∶4比例传代。将第3代hPDLSCs接种至6孔板上，培养至80%汇合度时，将细胞分为对照组和诱导组，对照组细胞不做处理，而诱导组细胞以含10 nmol/L地塞米松、0.05 mmol/L维生素C和10 mmol/L β-甘油磷酸钠的成骨诱导液培养。3 d换液/次，待培养14 d后采用RT-PCR检测GAS5、Runx2、ALP和OCN表达。

1.3 细胞转染

实验分为： (1)未转染组：正常培养； (2)NC-siRNA组：转染NC-siRNA； (3)GAS5-siRNA组：转染GAS5-siRNA； (4)GAS5-siRNA+antimiR-NC组：共转染GAS5-siRNA和antimiR-NC；GAS5-siRNA+antimiR-222-3p组：共转染GAS5-siRNA和antimiR-222-3p，其中，每组设3 个复孔。将hPDLSCs接种至6 孔板，培养至70%汇合度时，按照脂质体3000说明书对hPDLSCs进行瞬时转染；转染6 h后换液，培养48 h收集各组细胞，RT-PCR检测GAS5和miR-223-3p表达水平评价转染效率后，再以成骨诱导液培养。

1.4 茜素红染色

待1.2和1.3中各组细胞成骨诱导14 d后，磷酸缓冲液将各组细胞洗涤2 遍。4%多聚甲醛固定25 min后，茜素红染色15 min；洗去染液后，显微镜观察拍照。

1.5 RT-PCR检测

按照Trizol试剂说明书提取hPDLSCs总RNA后，紫外分光度计检测RNA浓度；将RNA行逆转录后，根据2×SYBR Green PCR Mastermix说明书上RT-PCR仪进行扩增，U6和β-actin作为内参，2-ΔΔCt法计算GAS5、miR-222-3p、Runx2、ALP和OCN mRNA表达。

1.6 双荧光素酶报告

基因实验采用Starbase2.0软件预测发现GAS5和miR-222-3p之间存在互补的结合位点。将野生和突变后的GAS5 3' UTR区克隆重组至psiCHENK2载体上，作为GAS5野生型(GAS5-WT)和突变型(GAS5-MUT)载体质粒；参照脂质体3000说明书将miR-223-3p模拟物、miR-NC分别与GAS5-WT、GAS5-MUT共转染至hPDLSCs中，分别标记为miR-223-3p+GAS5-WT、miR-NC+GAS5-WT、miR-223-3p+GAS5-MUT、miR-NC+GAS5-MUT，每组设3 个复孔；转染48 h后，根据试剂盒说明书检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.7 数据分析

2 结 果

2.1 成骨分化后GAS5表达上调

与对照组比较，诱导组hPDLSCs成骨诱导14 d后有钙化结节形成(图1)，Runx2(2.49±0.15vs1.00±0.00)、ALP(1.65±0.11vs1.00±0.00)和OCN(2.05±0.13vs1.00±0.00) mRNA表达升高且伴随着GAS5(3.56±0.18

图1 成骨诱导后PDSCs茜素红染色结果 (×200)vs 1.00±0.00)表达上调(P<0.05)。

2.2 转染后hPDLSCs中GAS5表达下调

与未转染组比较，NC-siRNA组中GAS5表达差异无统计学意义(0.94±0.09vs1.00±0.00，P>0.05)；然而，GAS5-siRNA组中GAS5表达(0.19±0.04)较NC-siRNA组降低(P<0.05)。

2.3 GAS5低表达抑制hPDLSCs成骨分化

NC-siRNA组与未转染组中钙化结节程度无差异，而GAS5-siRNA组中钙化结节程度较NC-siRNA组减轻(图2)；与未转染组比较，NC-siRNA组中Runx2(0.97±0.06vs1.00±0.00)、ALP(1.01±0.09vs1.00±0.00)、OCN(0.95±0.08vs1.00±0.00) mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)；与NC-siRNA组比较，GAS5-siRNA组中Runx2(0.48±0.04)、ALP(0.66±0.04)、OCN(0.52±0.03) mRNA表达降低(P<0.05)。

2.4 GAS5与miR-222-3p模拟共转染

GAS5与miR-222-3p之间存在互补的结合位点[3-4]； miR-222-3p模拟物和GAS5-WT共转染后荧光素酶活性较miR-NC降低(0.29±0.03vs1.00±0.00，P<0.05)，但miR-222-3p模拟物和GAS5-MUT共转染后荧光素酶活性和miR-NC相比(0.95±0.08vs1.00±0.00)差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 GAS5低表达上调hPDLSCs中miR-222-3p表达

NC-siRNA组和未转染组中miR-223-p表达(1.02±0.09、1.00±0.00)差异均无统计学意义(P>0.05)；GAS5-siRNA组中miR-223-p表达(2.73±0.13)较NC-siRNA组升高(P<0.05)。

图2 GAS5-siRNA处理后hPDLSCs茜素红染色结果(×200)

2.6 下调miR-222-3p逆转对GAS5低表达对hPDLSCs成骨分化的作用

与NC-siRNA组比较，GAS5-siRNA组中钙化结节程度减轻，而miR-222-3p(2.89±0.15vs1.00±0.00)表达升高，而Runx2(0.45±0.03vs1.00±0.00)、ALP(0.59±0.03vs1.00±0.00)和OCN (0.50±0.04vs1.00±0.00)mRNA表达降低(P<0.05)；与GAS5-siRNA组比较，GAS5-siRNA+antimiR-NC组之间钙化结节程度和miR-222-3p(2.95±0.19)以及Runx2(0.43±0.03)、ALP(0.61±0.04)和OCN (0.52±0.04)mRNA无明显差异(P>0.05)；与GAS5-siRNA+antimiR-NC组比较，GAS5-siRNA+antimiR-222-3p组中钙化结节程度加重(图3)，miR-222-3p表达(1.17±0.09)降低，而Runx2(0.64±0.04)、ALP(0.82±0.06)和OCN(0.77±0.05)mRNA表达升高(P<0.05)(图3)。

3 讨 论

GAS5是一种肿瘤抑制和生长停滞相关的lncRNA，与多种干细胞自我更新和分化有关。GAS5可通过维持NODAL信号来促进人胚胎干细胞自我更新[5]，通过调控miR-18a/CTGF轴负向调控间充质干细胞的成脂分化[6]； 通过调节miR-135a-5p/FOXO1促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[2]。然而，GAS5是否参与hPDLSCs成骨分化并不清楚。

ALP、Runx2和OCN是成骨分化的重要指标，其表达水平的高低可反映成骨分化能力的强弱[7]。本研究对hPDLSCs成骨诱导后发现，hPDLSCs有钙化结节形成，同时ALP、Runx2和OCN mRNA以及GAS5表达升高。结果表明，hPDLSCs成骨分化后GAS5表达上调。这提示，GAS5可能在hPDLSCs成骨分化过程中发挥着重要作用。转染GAS5-siRNA成功下调GAS5发现，hPDLSCs矿化结节能力减弱且ALP、Runx2、OCN mRNA表达降低。表明，下调GAS5表达可抑制hPDLSCs成骨分化。提示，在hPDLSCs成骨分化过程中GAS5发挥着积极作用。

图3 GAS5-siRNA+antimiR-222-3p处理后hPDLSCs茜素红染色结果(×200)

lncRNA可通过竞争性结合miRNA靶基因mRNA的3'-非编码区域间接抑制miRNA对mRNA的调控作用，还可作为竞争性内源RNA发挥海绵吸附作用抑制miRNA的表达[8]。本研究采用Starbase2.0软件预测发现GAS5和miR-222-3p之间存在互补的结合位点。miR-222-3p低表达可通过IGF-1/ERK途径和Smad5-Runx2信号轴促进骨髓间充质干细胞成骨分化[9-10]。双荧光素酶报告基因实验证实GAS5可与miR-222-3p靶向结合；另外，在GAS5低表达的hPDLSCs中发现miR-222-3p表达升高。进一步下调miR-222-3p表达后发现，GAS5低表达对hPDLSCs成骨分化的抑制作用减弱。这表明，GAS5可通过靶向miR-222-3p调控hPDLSCs成骨分化。

综上，hPDLSCs成骨分化后GAS5表达上调，下调GAS5表达可通过靶向调控miR-222-3p抑制hPDLSCs成骨分化。