赖谱富，李怡彬，翁敏劼，汤葆莎，吴俐，陈君琛

摘要：利用响应面法对海鲜菇副产物黄酮类化合物的提取工艺进行优化。在单因素试验基础上，选择料液比、提取温度、提取时间、乙醇浓度为自变量，黄酮类化合物得率为响应值，利用响应面分析法研究各自变量交互作用及其对黄酮类化合物得率的影响，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型。结果表明：海鲜菇副产物黄酮类化合物最佳提取工艺条件为料液比1∶28、提取温度50℃、提取时间14 h、乙醇浓度58%、振荡速率120 r·min-1，在此工艺条件下黄酮类化合物得率为341 mg·g-1。

关键词：海鲜菇;副产物;黄酮类化合物;提取;响应面法

中图分类号：TS 2555 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2021）02-0001-06

DOI： 1013651/jcnkifjnykj202102001

Optimization of Extraction Process for Flavonoids from the Byproducts of

Hypsizygus Marmoreus by Response Surface Methodology

LAI Pufu， LI Yibin， WENG Minjie， TANG Baosha， WU Li， CHEN Junchen

（Research Institute of AgriEngineering Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences/Agricultural

Product Processing Research Centre， Fujian Academy of Agricultural Sciences/National R & D Center For

Edible Fungi Processing Technology， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： The response surface methodology was used to optimize the extraction process of flavonoids from the byproducts of Hypsizygus marmoreus. On the basis of the single factor experiment， the solidliquid ratio， extraction temperature， extraction time and ethanol concentration were selected as the independent variables， and the yield of flavonoids was selected as the response value. Then， the interaction of each independent variable and its effect on the yield of flavonoids were studied by using the response surface method， and the prediction model of quadratic polynomial regression equation was obtained by simulation. The results showed that the optimal extraction conditions of the flavonoids from the byproducts of Hypsizygus marmoreus were as follows： the solidliquid ratio of 1∶28， extraction temperature of 50℃， extraction time of 14 h， ethanol concentration of 58%， and oscillation rate of 120 r·min-1. Under these conditions， the yield of the flavonoids was 341 mg·g-1.

Key words： Hypsizygus marmoreus; Byproduct; Flavonoids; Extraction; Response surface methodology

海鮮菇Hypsizygus marmoreus又名蟹味菇、真姬菇，富含蛋白质、黄酮、多糖、酚类以及微量元素等成分，具有抗氧化、消炎、抗肿瘤、降血脂、调节免疫等功效＼[1-3＼]，其在采收加工过程会产生5%～10%的副产物，当前大部分当作垃圾直接丢弃，既浪费资源又对人居环境造成污染＼[4＼]。目前关于海鲜菇副产物的营养品质，相关学者也进行了一些研究，林忠宁等＼[4＼]研究发现，真姬菇菇脚和菌糠蛋白质中总氨基酸含量为7150%和6592%，氨基酸种类齐全，具有较高的蛋白质营养价值;于洪超等＼[5＼]研究发现，真姬菇菌脚的多糖、总酚、黄酮、灰分及粗纤维等含量是子实体的142、102、121、115、169倍，开发利用价值较好;王丽等＼[6＼]研究发现，海鲜菇的盖、柄、根、幼菇及残菇中必需氨基酸模式与人体要求较接近，与其他食物营养搭配可提高营养价值;陶明煊等＼[7＼]研究发现，真姬菇菌柄中多糖、蛋白质含量均高于菌盖，其多糖清除超氧自由基和羟自由基能力较强。

黄酮类化合物在自然界广泛分布，因其毒性低、药理活性强等，在化妆品、医药、食品等工业中应用广泛＼[8＼]。目前，国内外学者对黄酮物质的提取已有众多研究，主要有水提取法、超声波提取法、有机溶剂提取法、生物酶解提取法、超临界萃取法、微波提取法、大孔树脂吸附法、加压流体提取法等＼[9-10＼]，每种方法都有其优缺点。吕鹏涛等＼[11＼]以工厂化海鲜菇菇根为原料，采用超声波辅助法提取总黄酮，总黄酮提取含量可达2178 mg·g-1;黄敏＼[12＼]研究蟹味菇总黄酮的超声提取工艺条件，在料液比1∶40、75%乙醇、70℃下超声提取20 min，总黄酮含量达0061%，但未见以海鲜菇副产物为原料提取黄酮类化合物的报道。本研究在前期研究的基础上，选用乙醇振荡法对海鲜菇副产物黄酮类化合物进行提取，在单因素试验探讨黄酮类化合物得率受液料比、提取温度、提取时间及乙醇浓度影响的基础上，应用响应面法对主要影响因素水平进行优化，为海鲜菇副产物黄酮类化合物提取的产业化提供依据。

1材料与方法

11材料与试剂

赖谱富等：响应面优化海鲜菇副产物黄酮类化合物提取工艺2021年第2期2021年第2期赖谱富等：响应面优化海鲜菇副产物黄酮类化合物提取工艺海鲜菇副产物系正常生长110～120 d后，采收分拣时未达到商品海鲜菇规格的小菇（菌盖直径小于15 cm，菌柄长度小于4 cm），由福建省同兴菌业有限责任公司提供。新鲜海鲜菇副产物清洗后60℃热泵烘干，含水率为82%左右。

芦丁标准品、三氯化铝、无水乙醇、醋酸钾均为分析纯。

12仪器与设备

BS2000S型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）; SP756P型紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）;RE501型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）;DLK2020型低温冷却循环泵（宁波新芝生物科技股份有限公司）;粉碎机（江苏常州宇通干燥设备有限公司）;SPH103B型恒温培养振荡器（上海世平实验设备有限公司）。

13试验方法

131工艺流程海鲜菇副产物→60℃条件下热泵烘干→粉碎后过50目筛→乙醇振荡法提取（振荡速率120 r·min-1）→测定黄酮类化合物得率。

132海鲜菇副产物黄酮类化合物的测定采用芦丁比色法＼[13＼]。

（1）标准曲线的制作。分别精确移取0、1、2、3、4、5 mL的芦丁标准品溶液于50 mL带塞比色管中，由于最后定容为15 mL，相当于0、03、06、09、12、15 mg的芦丁质量。于标准管中分别加入2 mL 三氯化铝溶液混匀，各加入2 mL醋酸钾溶液混匀，加入30%乙醇定容至15 mL，混匀，静置10～15 min，最后于415 nm处测定吸光值（B）。以芦丁标准品浓度A为横坐标，吸光度值B为纵坐标绘制标准曲线，并通过线性回归，得到回归方程B=05885A+00078，R2=09991。

（2）海鲜菇副产物黄酮类化合物的测定。精密吸取海鲜菇副产物黄酮类化合物样品溶液10 mL置于50 mL带塞玻璃比色管中，按芦丁标准曲线法测定黄酮类化合物含量，根据下列公式计算得率。

黄酮类化合物得率X=A/（m×V1/V2）

式中：X为试验中黄酮类化合物含量（以芦丁计），mg·g-1;m为试样的质量，g;A为测定用样液中芦丁的质量，mg;V1为测定用样液的体积，mL;V2为试样处理液的总体积，mL。

14试验设计

141海鲜菇副产物黄酮类化合物提取单因素试验（1）料液比对海鲜菇副产物黄酮类化合物得率的影响。按料液比为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35分别加入60%的乙醇，在120 r·min-1、50℃下振荡提取15 h，每个试验提取1次，重复2次。探讨海鲜菇副产物黄酮类化合物的得率受料液比的影响。（2）提取温度对海鲜菇副产物黄酮类化合物得率的影响。按料液比1∶25加入60%乙醇，分别在温度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下120 r·min-1振荡提取15 h，每个试验提取1次，重复2次。探讨海鲜菇副产物黄酮类化合物的得率受提取温度的影响。（3）提取时间对海鲜菇副产物黄酮类化合物得率的影响。按料液比1∶25加入60%乙醇，在50℃、120 r·min-1下分别振荡提取05、10、15、20、25 h，每个试验提取1次，重复2次。探讨海鲜菇副产物黄酮类化合物的得率受提取时间的影响。（4）乙醇浓度对海鲜菇副产物黄酮类化合物得率的影响。按料液比1∶25分别加入30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，在50℃、120 r·min-1下振蕩提取15 h，每个试验提取1次，重复2次。探讨海鲜菇副产物黄酮类化合物的得率受乙醇浓度的影响。

142海鲜菇副产物黄酮类化合物提取响应面试验设计综合单因素试验结果，本试验根据BoxBenhnken中心组合试验设计原理，选取影响海鲜菇副产物黄酮类化合物得率的主要影响因素料液比（X1）、提取温度（X2）、提取时间（X3）及乙醇浓度（X4）为试验因素，以黄酮类化合物得率为响应值，进行4 因素3 水平响应面分析试验，优化海鲜菇副产物黄酮类化合物提取工艺条件。因素水平编码见表1。

15数据统计分析

采用DesignerExpertV 8061对试验数据进行回归分析。

2结果与分析

21单因素试验结果

211料液比对海鲜菇副产物黄酮类化合物得率的影响从图1可知，随着料液比的增大，海鲜菇副产物黄酮类化合物得率先增大后减小，料液比为1∶25～1∶30的增幅趋势比1∶15～1∶25的趋势稍大，料液比1∶30后得率变小。这可能是因为海鲜菇副产物与乙醇的直接接触面积随着料液比的增大而增加，黄酮类化合物成分也随之更多溶解出来，但是当料液比超过1∶30时，杂质的溶出也随之增大，进而导致黄酮类化合物得率减小＼[14＼]。

212提取温度对海鲜菇副产物黄酮类化合物得率的影响由图2可知，随着温度的提高，海鲜菇副产物黄酮类化合物得率先增大后减小，在40～50℃增加幅度较大，之后呈缓慢下降趋势。一般来说，温度越高黄酮类化合物成分的溶出速率越快，但温度过高也会造成黄酮类化合物得率下降，这可能是因为高温破坏了海鲜菇副产物黄酮类化合物，且高温直接增加杂质的溶出，干扰黄酮类化合物含量的测定。

213提取时间对海鲜菇副产物黄酮类化合物得率的影响图3表明，提取时间在05～15 h，海鲜菇副产物黄酮类化合物的得率呈上升趋势，15 h后黄酮类化合物得率有所下降。这可能是因为黄酮类化合物成分在短时间内未充分溶出，其溶出率随着提取时间的延长而增加，但黄酮类化合物组分在过长提取时间下会被破坏，从而导致得率降低＼[14＼]。

214乙醇浓度对海鲜菇副产物黄酮类化合物得率的影响从图4可以看出，随着乙醇浓度的增大，海鲜菇副产物黄酮类化合物得率先增大后减小，乙醇浓度60%时得率最大。这可能是因为海鲜菇副产物黄酮类化合物的极性与60%乙醇的极性相似，同时脂溶性物质会随着乙醇浓度的升高而加速溶出，进而导致黄酮类化合物得率降低＼[15＼]。

22响应面试验结果及方差分析

响应面试验设计与结果见表2。经多元回归分析可知，各试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，经回归拟合后，得到各因素与综合值之间的多元二次回归方程。

Y=328-021X1-0009X2-016X3-021X4-011X1X2+0018X1X3-011X1X4-016X2X3-0085X2X4-021X3X4-031X12-070X22-031X32-040X42

221回归模型方差分析由表3可知，响应值Y（得率）回归模型高度显著（P<00001），一次项X1（料液比）、X3（提取时间）、X4（乙醇浓度）对海鲜菇副产物黄酮类化合物得率的影响差异均极显著（P<001），X2（提取温度）不显著;二次项X12、X22、X32、X42对海鲜菇副产物黄酮类化合物得率的影响差异均极显著（P<001）;交互项中只有X3X4对海鲜菇副产物黄酮类化合物得率的影响差异显著（P<005），其他交互项均不显著。4个因素对海鲜菇副产物黄酮类化合物得率的影响主次顺序为：X4（乙醇浓度）>X1（料液比）>X3（提取时间）>X2（提取温度）。

对二次回归方程进行F检验和失拟性检验，结果表明：模型P<00001，说明模型极显著;失拟项P=00564>005，说明模型拟合程度好，可用此模型进行分析和预测。

222因素交互作用对海鲜菇副产物黄酮类化合物得率的影响由图5可知，乙醇浓度和提取时间的交互作用对海鲜菇副产物黄酮类化合物得率的影响差异显著，随着乙醇浓度的升高和提取时间的延长，海鲜菇副产物黄酮类化合物得率呈先升高后降低的趋势，即在一定的乙醇浓度和提取时间条件下海鲜菇副产物黄酮类化合物得率具有极大值。海鲜菇副产物黄酮类化合物得率随乙醇浓度的变化幅度大于提取时间，表明乙醇浓度对得率的影响更为显著，这与上述单因素试验及方差分析的结果一致。

223海鲜菇副产物黄酮类化合物提取的工艺参数优化与模型验证由回归方程预测可得因素水平的最优组合，并将各因素水平换算为对应的实测值，得到海鲜菇副产物黄酮类化合物提取的最佳工艺参数为：料液比1∶284、提取温度5057℃、提取时间138 h和乙醇浓度5842%，在该条件下海鲜菇副产物黄酮类化合物得率为340 mg·g-1。考虑到实际操作可行性，将最佳工艺参数修正为：料液比1∶28、提取温度50℃、提取时间14 h和乙醇浓度58%。根据修正的最佳工艺条件，进行6次重复验证试验，测得海鲜菇副产物黄酮类化合物得率的均值为341 mg·g-1，与预测值基本接近，说明该方程与实际情况拟合很好，验证了该模型的可靠性，同时表明响应曲面法适用于海鲜菇副产物黄酮类化合物提取的工艺优化。

3结论

（1）利用响应面分析法建立了海鲜菇副产物黄酮类化合物乙醇振荡提取过程中提取温度、乙醇浓度、料液比、提取时间4个影响因素的回归模型，并对模型进行分析检验，试验结果表明响应面法优化海鲜菇副产物黄酮类化合物乙醇振荡提取工艺可行。

（2）通过响应面分析得出海鲜菇副产物黄酮类化合物最佳提取工艺条件为料液比1∶28、提取温度50℃、提取时间14 h、乙醇浓度58%、振荡速率120 r·min-1，在此工艺条件下黄酮类化合物得率为341 mg·g-1。

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（责任编辑：柯文辉）

赖谱富，李怡彬，翁敏劼，等响应面优化海鲜菇副产物黄酮类化合物提取工艺＼[J＼]福建农业科技，2021，51（2）：01-06.

优秀学者论坛

赖谱富，1983年生，副研究员，主要从事农产品保鲜加工及功能营养食品开发研究，主持国家公益类行业（农业）科研专项、国家标准制订、福建省科技计划、福建省现代农业产业技术体系等项目23项，获福建省科学技术奖二等奖2项（排名第3、4）、三等奖5项（排名第1、2、4各1项，2项排名第3），授权国家发明专利24项，发表学术论文53篇，其中6篇获中国农学会优秀论文、福建省自然科学优秀学术论文奖。现任福建省农业科学院农业工程技术研究所副所长、福建省现代农业食用菌产业技术体系加工岗位专家、福建省农业科学院创新团队首席专家，入选福建省首届青年托举人才工程、福建省农业科学院青年科技英才百人计划等。

收稿日期：2021-01-25

作者简介：赖谱富，男，1983年生，副研究员，主要从事农产品保鲜与加工研究。

*通信作者：陈君琛，男，1959年生，研究员，主要从事农产品加工及功能营养研究（Email：junchencc@sinacom）。

基金项目：国家重点研发计划项目（2018YFD0400203）;福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项（2019R1032-10）;福建省现代食用菌产业技术体系建设项目（闽财指〔2019〕897号）;福建省财政专项——福建省农业科学院科技创新团队建设项目（STIT2017-3-5）。响应面优化海鲜菇副产物黄酮类