王天钰+季欣怡+章熙东

摘 要 以鲫鱼的肌肉、卵和鳃的新鲜冷冻样品为实验材料，比较用传统方法和试剂盒法提取DNA的浓度和纯度。结果表明：从以上三种动物不同样品组织中均能提取到比较纯净完整的基因组DNA（A260/A280在1.8～2.0之间），而且从鱼卵、鱼鳃中提取的全基因组DNA浓度优于肌肉，能够更好的适用于后续的分子生物学试验研究。传统提取法DNA含量显著高于试剂盒法。

关键词 动物 基因组DNA 提取

中图分类号 Q-331 文献标志码 B

1 问题的提出

在苏教版生物必修2教材中安排了“DNA粗提取和鉴定”实验，以此加深学生对DNA这种细胞内重要有机物的了解。通过鸡血或香蕉细胞中DNA的粗提取实践，提取到了较多的絮状物。但对絮状物中DNA的含量是多少，老师并为对此做出讲解，由此激发了我们继续的探究欲望，因此继续进行DNA的细提取和DNA纯度检测实验。

2 问题的解决

天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，把P（蛋白质）除去，再除去细胞中的糖、RNA及无机离子等，从中分离出DNA。制备高纯度的DNA溶液是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200 kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验（如PCR）打下基础。由于DNA分子在生物体内的分布和含量不同，要选择合适的材料和方法提取DNA。DNA的提取方法有多种，比如SDS-蛋白酶K消化法、CTAB法和试剂盒法等。

2.1 实验准备

实验材料：鲫鱼（三种组织：鱼卵、鳃、肌肉）

实验方法：传统方法和试剂盒法

实验目的：筛选出选取哪一种组织和方法更适合在中学中开展DNA的细提取实验。

2.2 实验试剂

DNA提取试剂：ACL细胞裂解液；蛋白酶K；酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）；Tris饱和酚；无水乙醇；体积分数为75%的乙醇溶液；双蒸水。

细胞/组织基因DNA提取试剂盒（离心柱型，#GK0122）。

2.3 实验仪器

分析天平；高速离心机（H1202转头）；微量移液器；恒温水浴锅；高压蒸汽灭菌锅；纯水仪。

超微量DNA分析仪：2000C分光光度计。

2.4 实验操作

2.4.1 传统方法

（1） 取动物组织（如鱼的肌肉）约0.15 g于1.5 mL离心管中。

（2） 加入400 μL的ACL细胞裂解液，将组织剪碎成末，加入蛋白酶K 15 μL，置于55℃水浴消化4 h左右。

（3） 加等体积的Tris-饱和酚（500 μL），混匀4-5 min，12 000 rpm离心5 min（室温）。

（4） 取上清，放入新1.5 mL离心管中，加等体积酚∶氯仿∶异戊醇，混匀2 min，12 000 rpm离心5 min。

（5） 取上清，放入2.0 mL离心管中，加2倍体积的-20 ℃无水乙醇，充分混匀后，-20 ℃放置2 h。

（6） 12 000 rpm离心10 min，弃去上清液（缓慢倒掉即可）。

（7） 加入1 mL 75%的乙醇，洗涤1次，12 000 rpm离心2 min，弃乙醇（缓慢倒掉即可）。

（8） 将离心管倒置干燥30 min。

（9） 加100 μL的双蒸水溶解DNA，轻弹管壁，65℃温浴30 min。

2.4.2 试剂盒法（详见试剂盒操作说明书）

2.4.3 DNA的浓度和纯度检测

DNA的纯度由260 nm和280 nm处的光吸收（即A260/A280）的比值决定。取DNA溶液1μL，用超微量核酸蛋白分析仪测定其浓度和纯度，每个样品重复测定3次。

2.5 实验结果

DNA用无菌水溶解后在2000C分光光度计上测上述实验提取到的DNA纯度和浓度。结果如表1所示。

从表1数据可以看出，从以上三种动物不同样品组织中均能提取到比较纯净完整的基因组DNA（A260/A280在1.8～2.00之间），而且从鱼卵、鱼鳃中提取的全基因组DNA浓度优于肌肉，能够较好地适用于后续的分子生物学试验研究。

2.6 实验结论

（1） 实验所提取到的全基因组DNA包括线粒体中的DNA和细胞核中的DNA。由于鱼卵的细胞小于体细胞，因此同样重量的鱼卵中所含的细胞个数高于鱼肉细胞的个数，再加上鱼卵细胞要不断分裂和生长需要消耗较多的能量，因此全基因组DNA的含量高于肌肉细胞。

实验结果显示从鱼鳃中提取的全基因组DNA含量高于鱼肉细胞。查阅资料后推测鳃是鱼类的呼吸器官，同时还具有排泄氮代谢废物和参与渗透压调节的功能，尤其是通过主动运输的作用参与渗透压的调节，因此鳃中的线粒体含量较高。另外，鳃中的血管壁很薄，只有单层上皮细胞。而鱼肉细胞大都是肌肉细胞，肌细胞是多核细胞，但是肌原纤维的含量非常高。

（2） 通过对实验数据的综合分析，得出结论：从实验取材的易得性来看，鲫鱼鱼鳃更适合用于开展本实验。传统方法和试剂盒法均能提取到较高纯度和浓度的DNA，但考虑到中学生实验开展的时间安排，试剂盒法为首选。

2.7 实验反思

为了顺利开展探究实验，需要注意实验材料的选择。高中教材中选择的鸡血本应是一种理想材料，但对于学生而言该试验材料难以获得、保存条件要求高，实验室的既有设备不能很好地满足这些需求。相比之下，鲫鱼是人们日常生活中一种常见的食材来源，且动物细胞较植物细胞少了细胞壁，更易于释放细胞中的DNA。鲫鱼的肌肉、卵、鳃组织材料较易获取，且来源丰富，取材后分装于干净塑料袋在冰箱中冷冻保存即可，有利于实验的开展。

DNA的提取是分子生物学的基本实验，而分子实验作为生物学各领域都通用且不可或缺的的分析方法，在高中、大学甚至更高层次的学习都会涉及，因此为我们实验的开展提供了丰富的文献资源。我们对查阅到的相关实验方法做了相应的笔记，分析各个试剂的作用，不同方法的利弊，从而各取所长，科学选材，并设计出自己的较优实验方案。

在细提取操作之前，我们实验组成员先进行了高中教材中关于DNA粗提取和鉴定的实验，用到的材料有书本中建议的鸡血和香蕉，并对提取到的絮状物进行了二苯胺的鉴定，观察到了与教材描述一致的淡蓝色溶液的实验现象。通过对教材实验的不断重复，我们充分了解了提取和鉴定DNA的原理，为细提取试验中试剂的选择和使用奠定了理论基础。

在细提取实验中，由于裂解酶等的使用耗时较长（传统耗时近8 h，试剂盒近3 h），要如何有序进行是我们实验小组必须考虑的问题，计算好每步的时间节点，在不耽误正常上课的同时完成实验是非常有必要的。因此在实验的前一天就要精心安排好何时做何事，抓紧课间和午休，做到有条不紊，保证实验的有序进行。

另外，实验操作中总会遇到各式问题，这就要求我们学会自己分析和解决。比如在起初实验用移液枪吸取蛋白酶K时，1 mL的蛋白酶K预计可以用66次（每次吸取15 μL），结果10次就用完了，那么问题究竟出现在哪里？大家仔细回忆每次操作，都是按要求调整了移液枪的容量刻度（15 μL），按道理应该没有差错的。后来我们把所有先前在进行该步骤时用到的移液枪刻度调至15 μL，吸取清水并测量体积，结果有一位成员所取清水远多于其余成员。观察后发现，问题出现在选用的移液枪规格上。该同学所选用的量程为100～500 μL的移液枪显示刻度也可以调至15 μL，但取出的却仍是量程所规定最少的100 μL。我们总结这个问题，移液枪所取试剂体积是由枪内弹簧决定的，量程较大者内装弹簧的形变程度也是有限的，所以选取移液枪之前一定要仔细检查量程是否符合要求。这同时也提醒我们，移液枪用完后要调至最大量程防止弹簧因长时间压缩而产生范性形变。

参考文献：

[1] 唐晓明，林子杰，滕慰群.“香蕉细胞中DNA粗提取与鉴定”简化实验的研究[J]生物学通报，2013，48（2）.

[2] 齐玲倩.水果果肉中总DNA提取方法的比较研究[J].食品研究与开发，2016，37（5）.

[3] 刘娟.5种哺乳动物组织DNA提取比较研究[J].德州学院学报，2007，23（4）.