张诗璇 ，宋佳颖 ，梁贞 ，多吉卓玛 ，央拉 ，巴桑卓玛 ，3

1.西藏大学高原医学研究中心，西藏拉萨850000；2.复旦大学生命科学学院，上海200000；3.中国藏学研究所（珠峰研究院），西藏拉萨850000

进行基因组学的研究，需获取高纯度的基因大分子［1-3］，而高原地区由于压力等因素，使得提取试剂受到一定的影响，从而导致提取DNA 的浓度、纯度大幅下降，且DNA 溶液中各种物质的污染较为严重，原因主要是提取方法、试剂剂量以及溶液配制等方面。通常提取DNA 的方法应经济有效，可适用于-20 ℃以下冷冻的血液样本，同时保证DNA 质量［4］。研究表明，溶液沉淀法具有较高的核酸提取量，且DNA 纯度较好［5］。其提取原理［6］主要在于 DNA 的析出，受高原低气压影响，在温度恒定的条件下，气体分子的自由程在低压环境内会增加，分子自由度增加［7］，从而导致碰撞概率下降。同样，在DNA 提取液体中均不存在较强的成键离子，因此可排除液体间反作用离子阻力的影响，可近似地将液体离子看作气体分子，同理可得液体中离子的碰撞概率会下降。当碰撞概率下降时，DNA 分子相对不易进行键合作用溶解，这会使DNA 提取纯度及浓度大大下降，杂质含量极大增加，从而影响高原地区分子生物学的自主发展。本研究采用市售人类基因组全血DNA 沉淀法提取试剂盒与本文改良方法分别各提取1 000 例人群全血样本DNA，比较两种方法高原地区DNA提取效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 血液基因组DNA 提取试剂盒（沉淀型）DP318 为市售产品；分光光度计（Thermo-NANODROP 2000）购自美国Thermo 公司；无水乙醇和异丙醇均为分析纯。

1.2 DNA 纯度判断标准 1.6 < A260／A280< 2.0，超过此范围表明溶液中存在RNA 污染，而低于此范围表明溶液中存在蛋白质、酚类等污染；A260／ A230＞1.6，以排除溶液中存在污染物，如碳水化合物、盐类、多肽等。

1.3 试剂盒方法（以 1 000 μL 血液为例） 向 1 000 μL 抗凝血液（-40 ℃冻存1 年以上）中加入2 000 μL 细胞裂解液CL，颠倒混匀 5 次，13 400 × g 离心 1 min；弃上清，沉淀中加入500 μL 缓冲液 FG 与 5 μL Proteinase K 的混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块，65 ℃水浴10 min，其间颠倒混匀数次；加入500 μL 异丙醇，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA，13 400 × g 离心 5 min；弃上清，沉淀中加入 150 μL 70%乙醇，涡旋振荡 5 s，13 400 × g 离心 2 min；弃上清，重复加入 150 μL 70%乙醇，涡旋振荡 5 s，13 400 × g 离心 2 min；弃上清，空气干燥DNA 沉淀直至所有液体挥发干净（至少5 min），加入 200 μL 缓冲液 TB，低速涡旋 5 s，65 ℃加热10 min 至1 h 溶解DNA，期间轻弹数次助溶。检测浓度、吸光度、断裂程度。

1.4 改良方法（以 1 000 μL 血液为例）

1.4.1 细胞裂解 试剂盒方法中进行2 次裂解，本文改进方法为提高细胞裂解效率，共进行3 次裂解，共计加入CLA 溶液 2 100 ～ 3 000 μL，平均每次加入 700 ～ 1 000 μL，每次加入CLA 后均进行振荡操作，振荡至图1 碎片大小，不可过度振荡，每次中速振荡约20 s 即可，原方法中并未提及振荡时间段。转速依次为 20 096、15 072、15 072 × g。离心后去上清液的沉淀见图1。

1.4.2 混合液溶解DNA 与蛋白质的溶解去除 1 000 μL 样本中可加入 FG 溶液 700 ～ 1 000 μL 和蛋白酶 K 溶液 12.5 μL，立即振荡。加入混合液后放入恒温水浴锅（60 ～65 ℃）水浴40 ～ 60 min，取出。

1.4.3 DNA 析出 从水浴锅中取出后，加入1 000 μL 4 ℃冷藏的异丙醇，缓慢上下颠倒混匀约20 次直至沉淀析出（图2A），12 560 × g 离心 16 ～ 20 min。由于本方法 DNA 析出后较难聚合，建议离心时间增加，以避免去上清液时不慎将DNA 到出。

1.4.4 DNA 洗涤 离心后小心去除上清液［由于DNA 呈透明高密度流体状（图2B），较难从溶液中辨别出来，建议在灯光下去除上清液）］，加入70%冰乙醇溶液1 000 μL（考虑到高原地区乙醇易挥发的特性，为避免误差，建议配置71% ～73%的乙醇溶液），轻微上下颠倒混匀 15 ～ 20 次，12 560 × g离心3 min；去上清，沉淀为白色透明的结晶状物体（图2C）。同上步骤进行第2 次乙醇洗涤，以去除盐离子等污染物（图2D），倒置在洁净的滤纸或其他纸张上15 min（图2E），使乙醇流出后再正立放置于通风处开盖10 min；加入DNA溶解液（BL 溶液或超纯水）。

图1 细胞裂解过程

图2 DNA 析出与洗涤过程

1.4.5 注意事项 提取DNA 过程中为避免DNA 断裂应尽量防止剧烈振荡，如DNA 掉落应使用移液枪枪头轻轻吸起，不可反复抽吸以使DNA 断裂概率增加。同时本方法提取DNA 的浓度较高，因此溶解时可加大TB 用量。

1.5 统计学分析 通过R 语言（RStudio-R.3.5.2）对两种方法提取的 DNA 的浓度、吸光度（A260／ A280、A260／ A230）分布情况进行正态性检验，并进行Shapiro-Wilk、Wilcoxon-test 及T-test分析。以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

正态性检验结果显示，所有组别均不属于正态分布，呈现离散型变量分布特征，见表1 和图3。Shapiro-Wilk、Wilcoxontest 及T-test 分析结果显示，两种方法提取的DNA 浓度、A260／A280、A260／ A230差异均有统计学意义（P ＜ 0.01），见表1、图4和图5。表明市售沉淀法试剂盒提取标准不完全适用于高原地区DNA 的提取。

根据数据的均值［XcA= 26.5 ／ XcB= 199.5，X（A）A260／A280=1.2 ／ X（B）A260／A280= 1.8，X（A）A260／A230= 1.4 ／ X（B）A260／A230= 1.6］发现，本文改良方法的均值水平均远高于试剂盒的均值水平，且与标准DNA 指标相近。同时从吸光度的标准差角度分析，本文改良方法的实验结果相对于试剂盒更稳健，异常值较少，实验结果可靠［如 S（A）A260／A280= 0.12 ／ S（B）A260／A280= 0.05］。因此，从均值和标准差的角度进一步证明本文改良方法更适用于高原地区DNA 的提取。

图3 两种方法提取的DNA 吸光度分布情况

图4 分析结果的散点图

图5 分析结果的箱线图

表1 两种方法提取的DNA 浓度、吸光度比值的3 种检验结果

3 讨 论

据联合国环境规划署（United Nations Environment Programme，UNEP）报告，世界上约 12%人口受高原环境的影响［8］。在高原地区，高原病是困扰人们的难题，分子机制的研究逐渐成为疾病治愈的重要途径，而DNA 的提取质量是疾病大分子机制研究的重要一环。本文改良方法与普通试剂盒比较后发现，二者差异有统计学意义（P ＜0.01），市售试剂盒的提取方法及标准不完全适用于高原地区DNA 的提取，而本文改良的方法有效增加了DNA 的提取纯度及浓度。本实验为我国西藏地区分子生物学的发展提供了生物学技术支持。