慈兴元，王艾俐，叶一鸣，徐思诗，王佳贝，潘依琦，陈俊，张丽芳，赵孔南

温州医科大学分子病毒与免疫学研究所，浙江温州325035

细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependen- tkinase 4，CDK4）为一类丝 ／ 苏氨酸激酶，定位于染色体的12q13 区域［1］。可与细胞周期素D1（cyclin D1）结合，导致视网膜母细胞瘤基因（retinoblastomagene，pRB）磷酸化，使磷酸化的 pRB 与转录因子E2F发生分离，导致E2F 释放，进而调节细胞周期从G1期转向S 期，促进细胞周期进程［2］。研究表明，CDK4 在多种肿瘤组织及癌细胞中存在过表达及活化，与肿瘤的发生、发展及预后密切相关［3-4］，预示CDK4 可作为肿瘤生物治疗的一个重要靶点［5］。近年来，通过免疫动物制备多克隆抗体，以代替价格昂贵的商业化抗体成为研究热点。

本研究通过基因工程技术构建CDK4 原核表达质粒，并进行原核表达及蛋白纯化，利用重组蛋白免疫日本大耳白兔，制备抗CDK4 兔血清抗体，并鉴定其特异性。为进一步研究CDK4 生物学特性奠定了基础［5］。

1 材料与方法

1.1 标本 CDK4 阳性人宫颈癌组织蜡块由温州医科大学附属第一医院病理科提供。本研究方案获得该医院伦理委员会批准。

1.2 细胞、菌株及载体 宫颈癌Siha 细胞购自中科院上海细胞库；大肠埃希菌 BL21（DE3）菌株及pET21a（+）载体均购自美国Invitrogen 公司。

1.3 主要试剂及仪器 CDK4 商业化多克隆抗体购自美国CST 公司；HRP-羊抗兔IgG 抗体、兔源Histag 单克隆抗体-HRP 及 HRP-山羊抗鼠 IgG（H + L）均购自杭州联科生物技术股份有限公司；IPTG 购自上海杰瑞生物有限公司；镍螯合亲和层析胶购自德国Qiagen 公司；Hoechst 染料购自北京索莱宝科技有限公司；DMEM 培养基及胎牛血清（FBS）均购自美国Gbico 公司；……