杨安纳，王吟，杨东升，周艳萍，涂晶，卢佳，李茜，施金荣，王泽鋆，申硕

武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北武汉430207

新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2 型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）引起的新型呼吸道传染病。截至2021 年1月中旬，全球累计新冠确诊病例超过9 319 万，死亡病例达201 万以上，现仍以每天新增68 万感染病例的速度增长，尚无特效药，接种安全有效的疫苗建立群体免疫是遏制该病毒传播的最佳手段。目前，全球已有多种新冠疫苗进入临床研究，包括重组载体、DNA、脂质纳米颗粒mRNA、灭活病毒、减毒活病毒和蛋白质亚基疫苗等［1］。据WHO 统计，截至2020年12 月29 日，全球共有190 多个候选疫苗正在研发，其中50 多个已进入临床试验阶段，15 个已进入Ⅲ期临床试验［2］。

灭活剂 β-丙内酯（β-propiolactone，BPL）直接与病毒核酸分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤作用［3］，引起单链断裂或双螺旋链交联而达到灭活病毒的作用。与甲醛比较，BPL 对病毒具有更强的灭活作用，同时不破坏病原体蛋白的免疫原性；还可降低生物制品中残留宿主细胞DNA 的含量，并具有极易水解成无毒无害物质的特性，目前在国外应用于多种疫苗的灭活［4-6］。武汉生物制品研究所有限责任公司在新型冠状病毒灭活疫苗（Vero 细胞）研发中，以BPL 作为灭活剂，对烈性传染病病原体进行两步灭活，灭活效果更彻底，确保生产及接种使用的安全性。但BPL可引起碱基烷基化或酰基化，导致DNA 损伤，如去嘌呤突变，并发生A 至T 转位。在实验动物中，即使单次给药，BPL 也显示出高度致瘤性、遗传毒性和致癌性［7］。因此以其作为灭活剂进行疫苗生产时需对其残留进行工艺验证，确保符合国家疫苗质量监管部门的要求。目前BPL 残留的检测方法有高效液相色谱法和气相色谱法［8-10］。本研究针对新型冠状病毒灭活疫苗（Vero 细胞）中BPL 残留量建立气相色谱检测方法，并进行专属性、检测限、定量限、线性范围、重复性和耐用性验证，为病毒灭活验证工艺及质量控制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 疫苗浓缩液及原液 新型冠状病毒灭活疫苗（Vero 细胞）浓缩液（批号：202009Z001）及该疫苗原液（批号：202005Y009、202005Y010、202005Y011）由武汉生物制品研究所有限责任公司制备。

1.2 主要试剂及仪器 BPL 对照品（含量：1.146 g／mL）购自德国SERVA 公司；乙腈（色谱级，纯度为99.9%）购自国药集团化学试剂有限公司；Agilent DB-624 毛细管柱（30 m × 0.250 mm × 1.40 μm）和气相色谱仪（型号：Agilent 7890A）均购自美国Agilent 公司。

1.3 方法的建立 气相色谱条件：进样口温度为180 ℃，分流比为2 ∶1，载气为氮气，检测器温度为250 ℃，运行时间为 10 min［11］。

1.4 方法的优化

1.4.1 柱温条件的选择 分别采用升温程序［11］（初始温度：80 ℃，保持 1 min，以 20 ℃ ／ min 的速率升温至200 ℃，保持5 min，运行12 min）和等温程序（柱温：120 ℃，运行 10 min）进行检测，考察 BPL 峰的出峰时间和分离度。

1.4.2 流速的选择 分别采用 1 和 3 mL ／ min 流速进行检测，依据BPL 峰的分离度和拖尾因子选择方法的流速。

1.4.3 进样量的选择 分别进样1 和0.2 μL，进行检测，依据BPL 峰的分离度和拖尾因子选择方法的进样量。

1.5 方法的验证

1.5.1 专属性 取0.101 2 g BPL 对照品，置100 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成1 mg ／ mL 的BPL 对照品溶液；再进行 3 倍稀释，配制成 337 μg ／mL的 BPL 对照品溶液。用 1 mg ／ mL 的 BPL 对照品溶液与疫苗原液按1 ∶1 的比例混合（混合样品）。将1 mg ／ mL 的BPL 对照品溶液及混合样品按最佳条件进行检测，确定BPL 峰的保留时间和分离度，两者BPL 峰的保留时间应一致，分离度应 ＞1.5。同时以乙腈作为空白对照。

1.5.2 重复性 取 337 μg ／ mL 的 BPL 对照品溶液连续进样6 次，按最佳条件进行检测，计算峰面积和保留时间。峰面积和保留时间的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）应 ≤ 4.0%。

1.5.3 耐用性 取 337 μg ／ mL 的 BPL 对照品溶液，于不同检测器温度（245、250、255 ℃）、不同进样口温度（175、180、185 ℃）条件下，按最佳条件进行检测，计算峰面积和保留时间。峰面积和保留时间的 RSD 应 ≤ 4.0%。

1.5.4 线性范围 用乙腈配制浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.625、3.125 μg ／ mL 的 BPL 对照品溶液，按最佳条件进行检测，计算BPL 峰面积。以峰面积为横坐标，BPL 浓度为纵坐标进行线性回归分析，获得线性回归方程，相关系数（r）应 ≥0.999。

1.5.5 定量限及检测限 取 1 mg ／ mL 的 BPL 对照品溶液，用乙腈稀释100 倍，再进行4 倍稀释，按最佳条件进行检测，将信噪比10 ∶1 的样品浓度确定为此方法的定量限；再稀释3 倍，将信噪比3 ∶1 的样品浓度确定为此方法的检测限。

1.6 方法的应用

1.6.1 疫苗灭活过程中BPL 含量的检测 取已灭活水解的新型冠状病毒灭活疫苗（Vero 细胞）浓缩液，加入体积比为 1 ∶4 000 的 BPL，分别于 2 ～ 8 ℃放置 0、12、24、36、48 h 取样，按最佳条件进行检测，根据峰面积计算BPL 含量，并绘制含量与时间的变化曲线。

1.6.2 疫苗水解过程中BPL 含量的检测 取经BPL 灭活的的新型冠状病毒灭活疫苗（Vero 细胞）浓缩液，放置37 ℃进行水解，每隔30 min 取样，按最佳条件进行检测，根据峰面积计算BPL 含量，并绘制含量与时间的变化曲线。

1.6.3 疫苗原液中BPL 残留量的检测 取连续3批新型冠状病毒疫苗（Vero 细胞）原液，与乙腈按1 ∶1的比例混合后，采用最佳条件进行检测，计算疫苗原液中BPL 的残留量。

2 结 果

2.1 方法的优化 升温程序和等温程序BPL 峰出峰时间分别为5.163 和2.318 min，分离度分别为16.2 和 8.0。1 和 3 mL ／ min 流速检测的 BPL 峰拖尾因子分别为1.74 和1.34，分离度分别为8.6 和8.2。1 和0.2 μL 进样检测的BPL 峰拖尾因子分别为1.74和0.79，分离度分别为8.6 和5.8。因此确定该检测方法的最佳检测程序为等温程序，流速为3 mL／min，进样量为 0.2 μL。

2.2 方法的验证

2.2.1 专属性 337 μg ／mL 的 BPL 对照品溶液的乙腈峰及BPL 峰保留时间分别为1.185 和2.318 min，分离度为7.96。混合样品的乙腈峰和BPL 峰的保留时间分别为1.197 和2.328 min，分离度为2.14，且BPL 峰保留时间与BPL 对照品溶液一致。见图1。表明该方法能特异性检测新冠原液中的BPL 残留。

图1 BPL 的气相色谱检测图谱Fig.1 Gas chromatogram of BPL

2.2.2 重复性 BPL 对照品溶液连续进样6 次后，峰面积和保留时间的RSD 分别为1.3%和0.063%，均≤4.0%，见表1。表明该方法具有良好的重复性。

表1 重复性验证结果Tab.1 Verification for reproducibility

2.2.3 耐用性 BPL 对照品溶液在不同检测器温度及进样口温度条件下检测，峰面积和保留时间的RSD 分别为0.4%和0.036%，均 ≤ 4.0%，见表2。表明检测器温度及进样口温度对试验结果无明显影响。

表2 耐用性验证结果Tab.2 Verification for durability

2.2.4 线性范围 BPL 对照品溶液标准曲线见图2。BPL 对照品溶液在 3.125 ～ 500 μg ／ mL 浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，回归方程为y = 1.399 1 x - 0.558 6，r 为 0.999 9。

图2 气相色谱法检测BPL 含量的标准曲线Fig.2 Standard curve for determination of BPL content by gas chromatography

2.2.5 定量限及检测限 信噪比为10 ∶1 时，获得方法的定量限为2.530 μg／mL，峰面积为1.795 mAU*s；信噪比为 3 ∶1 时，获得方法的检测限为 0.843 μg ／mL，峰面积为0.496 mAU*s。

2.3 方法的应用

2.3.1 疫苗灭活过程中BPL 的含量 于2 ～8 ℃放置0 h 时BPL 含量明显低于实际加入量，证明BPL极易水解的特性，BPL 的含量随着时间逐渐降低，水解速度逐渐趋于平缓，水解48 h 后，含量高于定量限，见图3。表明BPL 加入量可保障病毒在48 h 内的持续灭活。

图3 灭活过程中BPL 含量的变化趋势Fig.3 Change trend of BPL content during inactivation

2.3.2 疫苗水解过程中BPL 的含量 BPL 在37 ℃水浴环境中逐渐水解，30 min 后其含量低于定量限，120 min 后远低于检测限，见图4。

图4 水解过程中BPL 含量的变化趋势Fig.4 Change trend of BPL content during hydrolysis

2.3.3 疫苗原液中BPL 的残留量 3 批新型冠状病毒疫苗（Vero 细胞）原液中均未检测到BPL 峰，表明原液中BPL 含量远低于该方法的检测限0.843 μg／mL，原液中几乎无BPL 残留。

3 讨 论

20 世纪50 年代，BPL 是生产丙烯酸的一种重要的商业化学品，也用于外科器械、血浆、组织移植、牛奶、水、培养基和酶的消毒。由于其具有良好的杀孢作用，被用于杀灭细菌、病原真菌和病毒［12-14］。《中国药典》三部（2015 版）［15］的冻干人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）制备要求中规定，对狂犬病病毒浓缩液的灭活按1 ∶4 000 比例加入BPL。武汉生物制品研究所有限责任公司在新型冠状病毒灭活疫苗（Vero细胞）前期研发中设立了4 个不同的BPL 工作浓度，即 1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000 及 1 ∶8 000，其中 1 ∶1 000 及 1 ∶2 000 在疫苗灭活过程中会引起抗原含量损失，1 ∶4 000 及 1 ∶8 000 对抗原影响较小，考虑到新型冠状病毒属于生物安全3 级以上病原微生物，且《中国药典》三部（2015 版）［15］人用疫苗总论规定，灭活工艺参数应至少为彻底灭活参数的2 倍，因此，本公司最终设定新型冠状病毒灭活疫苗（Vero 细胞）的灭活剂浓度为 1 ∶4 000，2 ～8 ℃条件下灭活时间不少于48 h，确保生产和接种的安全性。

新型冠状病毒其活毒操作均需在生物安全3级及3 级以上实验室中进行，本研究实验环境无法直接检测病毒浓缩液实际灭活过程中BPL 的含量变化，因此采用模拟灭活的方法间接检测疫苗灭活及水解过程中BPL 的含量变化，结果显示，按1 ∶4 000加入BPL，其含量在整个灭活过程中均高于定量限，于37 ℃水解2 h 后，BPL 含量低于方法的检测限。浓缩液经BPL 两次灭活、两步层析纯化后所得原液中无法检测到BPL 峰，表明原液中几乎无BPL 残留，符合安全生产需求及疫苗灭活剂残留标准的质量要求。

综上所述，本研究建立的气相色谱法操作简单、检测时间短、效率高、专属性强、重复性好，可满足疫苗中BPL 残留的检测需求。