简凤萍 罗燕艳 梁锐根 徐秀梅 邓文同

1 中山市博爱医院妇产科 (中山 528400)

2 中山市博爱医院病理科 (中山 528400)

宫颈癌是一个全球性的问题, 位居女性生殖道肿瘤第一位, 35 岁以下恶性肿瘤第一位[1-2]。 中国宫颈癌发病率15/10 万, 近年来发病趋势明显年轻化, 且早期患者增多[3]。 50 年以来大部分国家宫颈癌还以细胞学筛查为主, 但是细胞学灵敏度较低, 而HPV 初筛的临床应用缺点是具有特异度较低等局限性[4]。 近年来细胞学与HPV 检测联合筛查策略逐渐成为宫颈癌筛查共识。 穆启梅等[5]探讨了TCT、 HPV-DNA 分型检测在细胞检查结果≥ASCUS 和病理组织学检测≥CINⅠ患者的癌前病变筛查价值。 而WHO 发布的最新的宫颈疾病分类依据[6]认为包括CIN2 和CIN3 在内的HSIL 早期诊断给妇产科医师带来的挑战是巨大的。 而有创的病理活检常常不容易被接受。 探讨一种无创性的早期HSIL+显得非常迫切而重要。

本研究通过纵向比较 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和联合检测在不同级别宫颈病变的阳性率的差异, 横向比较p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和联合检测在相同宫颈病变的阳性率的差异, 综合评估 p16/Ki- 67 染色、 HPV E6/E-7mRNA 和联合检测诊断HSIL +病变效能的差异,旨在建立一种灵敏、 特异、 无创的HSIL +病变早期诊断方法。

1 资料与方法

1.1 材料收集

选取2017 年3 月—2020 年8 月期间, 于中山市博爱医院妇产科就诊, 组织学证实为宫颈炎患者209 例、 LSIL 患者 169 例、 HSIL 患者 131 例和宫颈癌患者86 例作为研究对象。 宫颈炎组患者年龄23 ～78 岁, 平均年龄 (41.9 ± 12.6) 岁; LSIL 组患者年龄 21 ～81 岁, 平均年龄 (42.3 ± 11.2)岁; HSIL 组患者年龄25 ～79 岁, 平均年龄 (43.6±9.8) 岁; 宫颈癌组患者年龄25 ～82 岁, 平均年龄 (43.5 ±13.0) 岁; 四组间年龄差异无统计学意义 (P＞0.05), 具有可比性。 入选标准: 研究对象均为宫颈原发性疾病; 未合并有其他肿瘤; 未接受过宫颈疾病的药物、 放化疗及靶向治疗; 非生理期、 非妊娠期、 非哺乳期。

1.2 设备与试剂

P16/Ki-67 染色抗体由美国 Ventana Medical Systems 公司生产。 HPV E6/E7mRNA 分子检测仪、ThinPrep2000 细胞制作仪购自美国 Hologic 公司。HPV E6/E7mRNA 检测试剂由科蒂亚生物公司生产。

1.3 标本制作与诊断

由妇产科医师采集患者宫颈标本并制作宫颈细胞薄片, 在阴道镜下, 采集宫颈病理标本, 固定、脱水、 包埋、 透明、 浸蜡、 包埋、 切片、 染色, 按参考文献执行[7]。 组织学诊断由2 位病理医师共同完成。

1.4 宫颈组织学诊断依据

宫颈组织学诊断结果依据WHO 发布的最新的Bethesda[6], 包括宫颈炎 (良性细胞改变)、 LSIL、HSIL、 宫颈癌。 LSIL 相当于原来的 CIN1, HSIL 相当于原来的CIN2 和CIN3。

1.5 p16/Ki-67 染色检测

利用免疫学抗原抗体分子由于结构的互补和彼此亲和性所发生特异性结合原理, 并通过氧化还原化学反应使标记抗体的酶显色剂显色来确定细胞内抗原, 对其进行定位、 定性。 实验设置阴阳性对照。 检测结果由病理医师在光学显微镜下对染色后薄片进行观察并进行判断。 阳性染色结果是指薄片中见一个以上细胞的细胞核呈红色着色、 细胞质呈黄色。 阴性染色结果是指薄片中除外同一细胞的细胞核呈红色着色、 细胞质呈黄色的所有情况[8-9]。见图1。

图1 p16/Ki-67 染色图像 (Envision 法, ×400)

1.6 HPV E6/E7mRNA 检测

采用HPV E6/E7mRNA 分子检测仪进行诊断,可检测 HPV16、 18、 31、 33 在内的 14 种高危型HPV。 HPV E6/E7mRNA 检测结果为阳性 (红色)、阴性 (黑色)。

1.7 联合检测

本实验中p16/Ki-67 和HPV E6/E7mRNA 联合检测采用并联的方式: 即两个实验结果中只要有一个为阳性即诊断为联合检测阳性。 只有两个实验结果同时为阴性才诊断为联合检测阴性。

1.8 统计学处理

使用SPSS 24.0 统计学软件完成数据分析, 率的比较采用χ2检验, 均数的比较采用方差分析 。HSIL+为本研究的终点 (包括HSIL 和宫颈癌)。HSIL- (包括 LSIL 和宫颈炎)。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和联合检测在不同级别宫颈病变的阳性率的比较

p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和联合检测阳性率随宫颈病变程度的加重呈趋势性升高(p16/Ki-67 染色:χ2=374.34,P＜ 0.001; HPV E6/E7mRNA 检测:χ2=289.21,P＜ 0.001; 联合检测检测:χ2=343.90,P＜0.001), 见表 1。

表1 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和联合检测阳性率与宫颈病变横向和纵向的比较 %

2.2 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和联合检测在相同级别宫颈病变的阳性率的比较

在宫颈炎、 LSIL、 宫颈癌组, p16/Ki-67 染色、HPV E6/E7mRNA 和联合检测阳性率之间差异均不具有统计学意义 (均P＞0.05)。 而在 HSIL 组,p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和联合检测阳性率总体差异有统计学意义 (χ2= 12.23,P=0.002)。 进一步两两比较发现: 在HSIL 组, p16/Ki-67 染色和HPV E6/E7mRNA 检测之间阳性率差异不具有统计学意义 (χ2= 0.29,P= 0.29);p16/Ki-67 染色和联合检测之间阳性率差异有统计学意义 (χ2=8.09,P=0.004); HPV E6/E7mRNA和联合检测之间阳性率差异有统计学意义 (χ2=11.30,P=0.001), 见表 1。

2.3 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和联合检测诊断HSIL+病变效能比较

表2 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和联合检测诊断HSIL+病变效能比较

本文以组织学诊断结果为金标准, p16/Ki-67染色、 HPV E6/E7mRNA 和联合检测诊断HSIL +病变的灵敏度、 特异度、 符合率见表2。 三种检测方法诊断HSIL +的灵敏度, 总体差异有统计学意义 (χ2= 7.69,P= 0.021)。 进一步两两比较,p16/Ki-67 染色和HPV E6/E7mRNA 检测法之间的灵敏度差异不具有统计学意义 (χ2=0.27,P=0.61); p16/Ki-67 染色与联合检测法之间的灵敏度差异有统计学意义 (χ2= 7.29,P= 0.007);HPV E6/E7mRNA 检测与联合检测法之间的灵敏度差异有统计学意义 (χ2=4.84,P=0.028)。 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和联合检测诊断HSIL +的特异度及符合率的总体差异不具有统计学意义0.628)。

3 讨 论

35 ～64 岁需要接受宫颈癌筛查的中国女性约3 亿, 宫颈癌筛查不是一道单选题, 理想的宫颈癌筛查方案应该是筛查益处最大化: 敏感性高,及早发现高级别癌前病变及已患浸润癌人群; 无痛、 无创、 成本低廉, 病人依从性好; 更加明确的临床管理。 潜在危害最小化: 特异性高、 找出真正向宫颈癌进展的病变; 简单的判读方式, 减少人为主观因素对结果的影响; 减少一过性HPV感染带来的心理压力和不必要的创伤检查。 细胞学、 组织病理学、 阴道镜医师缺乏规范化培训和质量控制参差不齐是目前国内宫颈癌筛查水平差距较大的主要原因。

2014 年WHO 女性生殖系统肿瘤推荐p16/Ki-67 用于宫颈病变辅助诊断[10]。 刘玉艳等[11]研究发现: p16/Ki-67 染色可提高细胞学检测的敏感性和HPV 检测的特异性, 有效提髙宫颈癌筛查效率。陈飞等[12]研究认为: HPV E6/E7mRNA、 p16 /Ki67 表达与宫颈病变程度密切相关, 可辅助ASCUS 患者的分流诊断。

mRNA 是一大类RNA 分子, 它将遗传信息从DNA 传递到核糖体, 在那里作为蛋白质合成模板并决定基因表达蛋白产物肽链的氨基酸序列。 E6、E7 是高危型HPV 病毒的两致癌基因, 是导致宫颈发生高级别病变乃至癌变的元凶。 在病毒感染的早期, E6、 E7 基因处于静默期, 不表达或者低表达mRNA, 一过性HPV 感染大多处于这个阶段。 约4/5 的女性一生当中都曾感染过HPV, 但大部分感染会在一到两年内自动清除或者被自身免疫力抑制, 不会呈持续性的阳性状态。

p16 是肿瘤抑制因子, Ki-67 是细胞增殖标志物, 在正常细胞周期中, p16 和Ki-67 不会同时表达在同一个细胞中。 反之, 如果p16 和Ki-67 同时表达在同一个细胞中, 说明细胞增殖失控, 极大概率提示宫颈高度病变和宫颈癌的发生。

表1 从纵向比较了p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和联合检测阳性率随宫颈病变程度的加重而升高, 反映出 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E-7mRNA 和联合检测与宫颈癌的发生是紧密相关的。这一研究结果与Daniela G[13]及Liu TY[14]等报道p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 检测与宫颈癌发生密切关联的研究结论一致。

表1 还从横向比较了宫颈炎、 LSIL、 宫颈癌组, p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和联合检测阳性率之间差异均不具有统计学意义 (均P＞0.05)。 而有趣的是在 HSIL 组, p16/Ki-67 染色、HPV E6/E7mRNA 和联合检测阳性率总体差异有统计学意义 (χ2=12.23,P=0.002)。 对于 HSIL 病例的早期诊断正是临床医师重点关注的病例, 而恰好p16/Ki-67 染色和HPV E6/E7mRNA 联合检测能更有效甄别这部分病例, 对于预防宫颈癌的发生具有重要的临床价值。 这一实验结论与王茂等[15-16]报道相一致。

本研究从重点考察指标灵敏度、 特异度、 符合率等报道 p16/Ki-67、 HPV E6/E7mRNA、 联合检测诊断HSIL+病变的临床价值, 表2 的研究结果反映出三种检测方法均可应用于HSIL+病变的筛查, 但是联合检测能显著提高HSIL +病变诊断的灵敏度,降低漏诊率, 同时保持了较好的特异度和符合率,建议将p16/Ki-67 染色和HPV E6/E7mRNA 联合检测作为早期诊断HSIL+病变的策略。

与此同时, 我们应该看到联合检测在有效提高筛查灵敏度的同时, 降低了特异度, 而且增加了患者的经济负担。 如何甄别联合检测的假阳性病例,确保其特异性, 而且进一步合理联合检测的费用,这是摆在妇产科医师和病理医师面前的机遇和挑战, 如果能解决这些问题, 将会使更多宫颈癌前病变患者被早期发现, 为女性的生命健康保驾护航。