李伟明，郑玉玲，尹怡，王俊涛，王祥麒

1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450008

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，我国食管癌高发，河南、河北、山西是食管癌发生率最高的三个省，目前研究已证明吸烟和重度饮酒是其发病的重要原因[1]。由于食管癌早期症状不明显，所以大多数患者发展到晚期才发现，食管癌的病理分型以鳞癌为主，约占70%～80%以上，中晚期的食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）主要的治疗方法是以化疗和放疗为主，5年生存率只有10%～20%左右[2]。豆根管食通口服液是河南中医药大学郑玉玲教授总结30 多年临床经验而研制出来的中药制剂，在治疗中晚期食管癌方面具有较好疗效，王新杰通过临床观察食管癌60 例，对比替加氟片，豆根管食通口服液能明显改善患者吞咽困难，胸骨后闷胀等症状，改善卡氏评分，升高血清IL6，降低血清IL10，提高IgM、IgA、IgG，治疗两个疗程后总有效率为46.7%[2]。王祥麒通过豆根管食通口服液灌胃治疗食管癌动物模型，发现其能促进大鼠食管癌细胞凋亡，其作用机制可能与其提高Fas 表达、降低FasL表达有关[3]。王玲玲在体外研究发现豆根管食通口服液具有明显抑制Eca-109细胞的作用，与药物浓度呈正相关，还可下调Eca-109细胞的端粒酶活性[4]，但是其治疗食管癌的作用机制还不明确。巴云涛发现miR-377 能够增加食管癌细胞TE-1 的放射敏感性，其机制可能是抑制AKT1/GSK-3β 信号通路[5]。方娜等[6]发现circ_0072088 靶向调节miR-377，上调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF）基因表达，在体外促进ESCC 细胞增殖、迁移和侵袭。因此，本研究采用RT-PCR的方法检测miR-377的表达，探讨豆根管食通口服液对ESCC的疗效及对miR-377的影响。

1 材料与仪器

1.1 试剂RPMI-1640培养液(杭州基诺生物医药公司），胎牛血清(上海臻诺生物科技有限公司、MTT 试剂盒）艾博抗生物公司，凋亡试剂盒(Applied BioProbes公司）、RT-PCR试剂盒(北京百奥莱博公司）、WB试剂盒(默沙克生物公司）。

1.2 仪器细胞培养箱(美国Sigma公司）、超净工作台(苏州苏洁医疗）、PCR扩增仪(赛默飞世尔公司）、电泳槽(伯乐电泳槽公司）、流式细胞仪(Abcam公司）。

1.3 豆根管食通口服液由河南中医药大学第一附属医院制剂室提供，由山豆根、制天南星、急性子、黄药子、姜半夏、沉香、郁金、三七等制成，每支10 ml，含生药1 g/ml。批号：020425。

1.4 细胞株KYSE450 细胞，由中国科学院细胞库提供。

1.5 SD大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证：SCXK(京）2018-0005。

2 方法

2.1 豆根管食通口服液含药血清的制备

SD大鼠60只雌雄各半，将豆根管食通口服液分为高中低三个剂量组，剂量分别为20 g/kg、10 g/kg、5 g/kg，每天给药2次，连续3天，末次给药后1 h采血。经过灭火和灭菌处理，低温保存。

2.2 豆根管食通口服液含药血清不同浓度、不同时间点对KYSE450细胞增殖的影响

KYSE450 细胞贴壁生长于RPMI-1640 培养液中，在37.0 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中，每周换液2～3 次，当细胞处于对数生长期的时候开始实验，将细胞混匀并依次接种到96 孔板中，分别加入豆根管食通口服液含药血清高中低剂量组(20%、10%、5%），并放置在细胞培养箱中，继续培养24 h、48 h、72 h。测试前每孔加入MTT 试剂10 uL，检测每孔的光密度值(optical density，OD），重复3次测量取平均值。根据细胞抑制率确定豆根管食通口服液含药血清中剂量组(10%）为最佳浓度，然后将KYSE450 细胞分为空白组、豆根管食通口服液含药血清中剂量组(10%）、氟尿嘧啶组，再次进行细胞增殖MTT检测。

2.3 豆根管食通口服液含药血清中剂量组对KYSE450细胞凋亡的影响

将各组KYSE450 细胞(0.5-1.0×106）用PBS 洗2次，加入100ulBindingBuffer和FITC标记的Annexin-V，常温避光30 min，加入PI 5ul，避光反应5 min，然后加入Binding Buffer 400ul，用FACScan快速进行流式细胞定量检测，同时设置一管为阴性对照(未加AnnexinV-FITC及PI）。

2.4 豆根管食通口服液含药血清中剂量组对KYSE450细胞miR-377的影响

使用Trizol试剂提取总RNA，通过分光光度计进行定量，并通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。总共使用5μgRNA 合成第1 链cDNA，并稀释至100μl。随后，将2.5μl稀释的cDNA 混合物用于最终25μl 反应体积中的PCR 扩增。miR-377 的PCR引物序列下：3’-UGUUUUCAACGGAAACACACU A-5’(F）；5’-CUACCUCCUUCCAGUUGGU-3’(R）。PCR 扩增进行35 个循环，产物长度为122 bp。

2.5 豆根管食通口服液含药血清中剂量组对KYSE450细胞CD133和VEGF的影响

收集各组细胞，加入一定的RIPA 重悬细胞，裂解离心后收集含有蛋白的上清液，测量蛋白浓度，加入适量的4 × Loading buffer，混匀后煮沸5 min。上样后电泳，转膜，抗原封闭，一抗4 ℃过夜。用含有5%脱脂奶粉稀释羊抗鼠IgG，室温孵育1h，滴加显影液，置于暗室内孵育2 min 后，用X光片进行曝光。

2.6 统计学处理

采用SPSS19.0进行分析，计数资料以均数±标准差(）表示，使用多个样本均数比较的单因素方差分析。以α=0.05 为检验水准，P＜0.05 具有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度豆根管食通口服液含药血清在不同时间点对KYSE450细胞增殖的影响

显微镜下观察不同剂量的豆根管食通口服液含药血清对KYSE450 细胞的增殖有明显的抑制作用，且在3个时间点存在明显的时间依赖性和浓度依赖性。各剂量组OD值均低于空白对照组且差异有统计学意义(P＜0.05）(见表1、图1）。因此选择豆根管食通口服液含药血清中剂量组(10%）作用48 h 进行下一步的研究。然后将KYSE450 细胞分为空白组、豆根管食通口服液含药血清中剂量组(10%）、氟尿嘧啶组(终浓度为100 ug/ml），作用48 h，观察形态学变化，通过MTT 检测增殖情况(见图2-3）。

表1 豆根管食通口服液含药血清作用KYSE450细胞48 h的影响Table1 Effect of Dou Genguan Shitong Oral Liquid with Serum on KYSE450 Cells for 48 h

图1 豆根管食通口服液含药血清分别作用KYSE450细胞24 h、48 h、72 h的OD值Figure1 OD values of Dou Genguan Shitong Oral Liquid with Serum on KYSE450 Cells for 24 h、48 h、72 h

图2 不同组别对KYSE450细胞的形态学变化Figure 2 Morphological changes of KYSE450 cells in different groups

图3 MTT法测定不同组别对KYSE450细胞的影响Figure 3 The effects of different groups on KYSE450 cells were determined by MTT assay

3.2 豆根管食通口服液含药血清中剂量组对KYSE450细胞凋亡的影响

将KYSE450 细胞分为空白组、豆根管食通口服液含药血清中剂量组(10%）、氟尿嘧啶组(100 ug/ml），作用48 h，流式细胞仪结果显示，空白组的细胞凋亡率为(5.4±0.63）%，豆根管食通口服液含药血清中剂量组的细胞凋亡率为(18.8±2.66）%，氟尿嘧啶组的细胞凋亡率为(26.1 ±2.95）%，统计学分析显示，给药组与空白组相比，两组的细胞凋亡率均高于空白组(P＜0.01），见表2和图4-5。

3.3 豆根管食通口服液含药血清中剂量组对KYSE450细胞miR-377的影响

将KYSE450 细胞分为空白组、豆根管食通口服液含药血清中剂量组(10%）、氟尿嘧啶组(100 ug/ml），作用48h，RT-PCR 结果显示，豆根管食通口服液含药血清中剂量组和氟尿嘧啶组miR-377表达增高，与空白对照组相比，差异有统计学意义，P＜0.05(P=0.025，P=0.017），见图6、图7。

表2 豆根管食通口服液含药血清作用KYSE450细胞对凋亡的影响Table 2 Effect of Dou Genguan Shitong Oral Liquid with Serum on apoptosis of KYSE450 Cells

图4 各组KYSE450细胞的凋亡率Figure 4 Apoptosis rate of KYSE450 cells of different groups

图5 不同组别KYSE450细胞的凋亡率Figure 5 Apoptosis rate of KYSE450 cells of different groups

3.4 豆根管食通口服液含药血清中剂量组对KYSE450细胞CD133和VEGF蛋白表达的影响

图6 不同组别细胞的miR-377表达Figure 6 Expression of miR-377 in different groups

图7 不同组别细胞miR-377表达量半定量分析Figure 7 Semi-quantitative analysis of expression of miR-377 in different groups

将KYSE450 细胞分为空白组、豆根管食通口服液含药血清中剂量组(10%）、氟尿嘧啶组(100 ug/ml），作用48 h，WB结果显示，豆根管食通口服液含药血清中剂量组和氟尿嘧啶组CD133表达下调，与空白对照组相比，差异有统计学意义，P＜0.05(P=0.028，P=0.027），VEGF表达下调，与空白对照组相比，差异有统计学意义，P＜0.05(P=0.030，P=0.025），见图8-10。

4 讨论

食管癌属于中医“噎膈”范畴，古代医家多认为本病的病因病机是情志不畅，肝气郁结；或者忧思过度，思虑伤脾；或饮食不节，肥甘厚腻辛辣刺激均可损伤脾胃，造成气滞水聚，痰湿凝结，积聚成块；或年老体衰，正气亏虚，癌毒瘤邪乘虚而入[7]。《景岳全书·噎膈》所言：“噎膈一证，必以忧愁思虑，积劳积郁，或酒色过度，损伤而成”，是对噎膈的病因认识[8]。目前食管癌仍然是世界上最危险的癌症之一，生存能力差，治疗手段有限。

图8 不同组别细胞VEGF和CD133蛋白的表达Figure 8 Expression of VEGF and CD133 proteins in different groups

图9 不同组别细胞CD133蛋白表达的半定量分析Figure 9 Semi-quantitative analysis of expression of CD133protein in different groups

图10 不同组别细胞VEGF蛋白表达的半定量分析Figure 10 Semi-quantitative analysis of expression of VEGF protein in different groups

郑玉玲根据自己的临床经验，结合食管癌的病因病机，提出了“豁痰化瘀解毒”的治疗方法，依据中药药性药效及现代药理研究，精心组方遣药，在临床上反复验证最终形成了豆根管食通口服液，该方以山豆根为君，制南星、姜半夏、急性子、黄药子、郁金、沉香为臣，三七为佐使[9]，山豆根解毒散结消肿，制南星温散化痰、姜半夏降气化痰散结、急性子软坚破血消积、黄药子凉血解毒化痰散结、郁金活血行气解毒散结、沉香行气降逆，三七散瘀消肿止痛。全方共奏解毒散结、豁痰化瘀之功效，适用于中医辨证为痰气交阻、津亏热结、瘀血内结型的食管癌患者[10]。中晚期食管癌大多属于本虚标实，治疗方法以扶正祛邪为主，豆根管食通口服液攻补兼施，临床也证实对中晚期食管癌有确切疗效，郑玉玲观察60 例中晚期食管癌患者，辨证属于痰气交阻、瘀血内结或痰瘀互结者，对肝肾功无明显影响，钡餐检查提示食管癌的分级减轻，尤其是治疗前3、4 级的患者，治疗两个周期后，有效率达到50%[11]。

microRNAs 的发现是肿瘤研究的里程碑，miR-377位于14q32染色体区域，是miRNA家族中重要一员。2017年3月香港大学医学院生物医学系李冰洁团队研究发现miR-377 在食管鳞癌患者的肿瘤组织和血清中的表达明显下调[12]，过表达miR-377 抑制ESCC 肿瘤的发生、生长、血管生成以及ESCC细胞的转移定植，而沉默miR-377则具有相反的作用。而且肿瘤组织和血清中miR-377表达水平与患者生存率呈正相关，较高的血清miR-377表达与肿瘤病理分期、远处转移、残留肿瘤状态以及放化疗耐药性呈负相关[13]。验证了miR-377 在抑制食管鳞癌发生发展中的作用与CD133和VEGF有关，可能是一种有前景的无创诊断、预后生物标志物和ESCC 患者的治疗策略[14]，但是miR-377 在食管鳞癌中的生物学功能、临床意义及治疗意义还需要进一步的研究。

在本研究中，本实验体外实验证实豆根管食通口服液能够抑制KYSE450 细胞增殖，MTT 结果显示对细胞增殖的抑制效果与药物浓度和作用时间呈正相关，其中豆根管食通口服液含药血清中剂量组能够诱导细胞凋亡，细胞凋亡率高于空白对照组，能够促进miR-377基因表达。EL B等[14]研究在ESCC组织和细胞中显著过表达机制上，miR-377 通过直接结合到3′非翻译区来调节CD133 和VEGF。因此本实验通过检测CD133 和VEGF 蛋白表达，豆根管食通口服液含药血清中剂量组CD133表达下调、VEGF表达下调。因此，本实验证实豆根管食通口服液对食管鳞癌KYSE450 细胞株有抗增殖、促凋亡的作用，其机制可能是通过上调miR-377的表达，进而抑制CD133和VEGF表达。

本研究揭示了豆根管食通口服液抗食管鳞癌的部分作用机理，为该药的临床应用进一步提供了理论依据，但还需要进一步验证。