卢凯 王香云 余红

外泌体是一种细胞分泌的纳米囊泡，可以用于 诊断和治疗肿瘤、心脑血管疾病[1]。近年来，研究发现微小RNA（microRNA，miR）参与了细胞增殖、凋亡、基因表达调控等多个过程，也参与了冠心病的发生、发展过程[2]。其中miR-210 是一种缺氧调控的miR[3]，其在缺氧环境下显著升高，而冠心病的本质即是心肌的缺血、缺氧。本文通过检测冠心病患者血清外泌体中miR-210 的表达水平，探讨其与冠心病病情严重程度及预后的关系，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016 年1 月至2018 年12 月湖州市第一人民医院收治的冠心病患者102 例（冠心病组），冠心病的诊断符合WHO 关于《缺血性心脏病的命名和诊断标准》,且冠脉造影证实至少1 支冠状动脉狭窄≥50%；另择同期在本院体检、既往无心脏病史的健康者98 例为对照组。排除标准：合并感染、其他系统疾病，恶性肿瘤，既往有心肌梗死、冠状动脉支架植入术或冠状动脉搭桥术史等。本研究经医院医学伦理委员会批准（批准文号：2018ky038），所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 Trizol 试剂（美国Invitrogen Life Technologies 公司，批号：15596026），miRNA 反转录试剂盒（美国ABI 公司，批号：11754050），外泌体提取试剂盒（美国Sigma-Aldrich 公司，批号：4484450），SYBR Prime Script RT-PCR Kit （日 本TaKaRa 公司，批号：RR086A），荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司，型号：7500）。PCR 引物购自广州锐博生物科技有限公司（批号：MQPS0000810-1-100）。

1.3 方法

1.3.1 一般资料收集 收集患者病史、体检结果、实验室检查及心电图、心脏超声等资料。所有对象实验室指标均以清晨空腹外周静脉血检测结果为准，包括甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、脂蛋白a 等；心脏超声测量左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.3.2 血清外泌体提取及鉴定 外泌体提取按照试剂盒说明书操作，具体步骤：（1）所有血清样本首先经2 000 g 离心30 min，去除细胞和细胞碎片，收集上清液转移到新的离心管中；（2）加入0.2 倍上清液体积的外泌体提取试剂到上清液中并混匀，并于2～8 ℃环境中孵育30 min；（3）室温下10 000 g 离心10 min，弃去上清液，外泌体即沉淀在试管底部；（4）用适量PBS（100～500 μL）重悬，冻存于-80 ℃环境中备用。外泌体鉴定：通过蛋白印迹法检测外泌体表面标志物Alix 的表达，通过电镜观察外泌体的典型形态和粒径大小。

1.3.3 外泌体miR-210 的提取和测定 采用Trizol提取外泌体总RNA 并监测RNA 纯度，以吸光度＞1.8 OD 值用于后续检测。将提取的总RNA 使用miR cDNA 试剂盒，根据说明书反转录cDNA。采用线虫cel-miR-39 作为内参，应用SYBR Green 实时荧光技术定量检测两组对象血清miR-210 的相对表达量。采用相对Cq 法（ΔCq）分析miR-210 表达水平。

1.3.4 随访 通过对患者或家属电话随访1 年，记录患者发生主要不良心血管事件及存活状况。主要不良心血管事件包括：急性冠脉综合征、心力衰竭、心血管死亡以及复合终点。根据血清外泌体miR-210 表达均值将冠心病组分为高表达者和低表达者，分析血清外泌体miR-210 表达与患者主要不良心血管事件和死亡的关系。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件，计量资料以 表示，组间比较采用t 检验；计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson 相关。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组对象一般资料比较 两组对象除LDL-C、脂蛋白a 指标差异有统计学意义外（均P＜0.05），其余指标差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 两组对象一般资料比较

2.2 血清外泌体的鉴定 见图1。

由图1 可见，在电镜下观察外泌体的形态，与文献报道一致[4]，囊泡直径约100 nm，形态如杯口状。

图1 血清外泌体的鉴定（A：电镜下外泌体的形态；B：蛋白印迹法检测表面标记蛋白Alix 的条带图）

2.3 两组对象外泌体miR-210 表达水平比较 冠心病组外泌体miR-210 表达水平15.70±9.87，高于对照组8.54±6.21，差异有统计学意义（t=6.24，P＜0.01）。

2.4 血清外泌体miR-210 与脂蛋白a、LDL-C 的相关性分析 将表1 有统计学意义的指标纳入相关性分析，结果显示血清外泌体miR-210 与脂蛋白a、LDL-C 均呈正相关（r=0.657、0.624，均P＜0.01）。

2.5 血清外泌体miR-210 对冠心病的诊断价值血清外泌体miR-210 诊断冠心病的ROC 曲线下面积为0.852，在最佳截断处灵敏度为80.4%、特异度为78.7%，见图2。

图2 血清外泌体miR-210 诊断冠心病的ROC 曲线

2.6 血清外泌体miR-210 表达水平与患者主要不良心血管事件和死亡的关系 所有冠心病患者随访1 年，发生主要不良心血管事件36 例，死亡14 例。miR-210 高表达（miR-210≥15.7）者44 例，发生主要不良心血管事件20 例（45.45%），死亡10 例（22.72%）；低表达（miR-210＜15.7）者58 例，发生主要不良心血管事件16 例（27.59%），死亡4 例（6.9%），两者主要心血管事件发生率及病死率比较差异均有统计学意义（χ2=66.0、88.0，均P＜0.01）。

3 讨论

在我国心血管疾病的发病率及死亡率逐年增高。其中冠心病已经成为人类的“杀手”之一，并呈年轻化趋势，造成的社会负担日益加重。冠状动脉急性缺血导致的心肌缺血缺氧的致死率极高，因此早期诊断及治疗冠心病非常重要。

外泌体是细胞分泌的一种有膜结构的纳米囊泡，其直径在100 nm 左右的，绝大多数细胞均可分泌外泌体[4]。在病理生理过程中，外泌体可能参与细胞-细胞之间的信号传递，其可以传递脂质、蛋白、miR 等成分。近年来外泌体被广泛应用于肿瘤的早期诊断、随访等[5]。miR 是一类由18～25 个核苷酸组成的非编码RNA，由于其具有转录后调控功能，使其在疾病的发生、发展中拥有不可忽视的重要作用。有研究发现miR 参与冠心病、心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的发生、发展过程[6-7]。且有研究发现在心肌梗死早期即可检测到心肌特异性miR 的表达，提示miR 有希望成为新一代的诊断标志物[8-9]。

本研究发现，冠心病组血清miR-210 水平显著升高，相对表达水平为15.70±9.87，高于对照组8.54±6.21。既往研究发现，miR-210 是一种缺氧调控的microRNA，其普遍表达在缺氧状态下的细胞和组织中，并且miR-210 由缺氧诱导因子1-α 特异性调控[10]。miR-210 参与调节细胞周期、促进血管新生和DNA 损伤修复、改善线粒体代谢等[11-14]。本研究同时也发现血清外泌体miR-210 水平与LDL-C、脂蛋白a 均呈正相关，提示其可能与动脉粥样硬化的发生、发展相关。为了评估对冠心病的诊断价值，本研究计算了外泌体miR-210 诊断冠心病的ROC曲线下面积为0.852，在最佳截断处灵敏度为80.4%、特异度为78.7%，可见外泌体miR-210 诊断冠心病具有较好的灵敏度和特异度。为了进一步研究血清外泌体miR-210 水平与冠心病患者预后的关系，本研究对冠心病患者随访1 年，发现血清外泌体miR-210 高表达者主要不良心血管事件发生率及病死率明显增加，提示血清外泌体miR-210 与冠心病患者预后相关，并且高表达者的预后不佳。

因此，临床上可通过检测血清外泌体miR-210的表达水平对冠心病进行早期诊断、危险分层及预后分析。但是由于本研究样本量较少，未来仍需进一步大样本证实。