徐先立 韩壮 张忠文

1 沈阳农业大学医院骨科，沈阳 110866；2 中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳110001

骨坏死是一种比较常见的骨科疾病，指由于循环障碍导致的骨细胞和骨髓细胞缺血性死亡［1］。糖皮质激素（GCs）是广泛用于治疗炎症或自身免疫性疾病的药物，包括关节炎、系统性红斑狼疮和严重过敏反应［2］。近年来，大量研究表明过量使用GCs 会抑制成骨细胞增殖并促进其凋亡，从而导致患者发生非创伤性骨坏死［3-4］。长期接受GCs治疗的患者骨折发生率为30%～50%［5］。因此，探讨GCs介导的成骨细胞增殖和凋亡的分子机制至关重要，这可能有助于开发缓解GCs 诱导骨坏死的有效治疗方法。Dex 是一种人工合成的糖皮质激素，可用于治疗红斑狼疮、牛皮癣、过敏性疾病和慢性阻塞性肺疾病等多种疾病［6］。Sato AY等［7］的研究指出活性氧/内质网应激（ROS/ER）与Dex 诱导的成骨细胞和骨细胞凋亡有关。但仍需更多的研究来进一步探索Dex 诱导成骨细胞凋亡的分子机制。在本研究中，我们旨在研究ROS 在Dex 诱导的成骨细胞凋亡中的作用，为进一步了解Dex 诱导成骨细胞凋亡的分子机制提供可能的思路，并为减轻Dex 诱导的成骨细胞损伤和骨坏死提供可能的治疗靶标。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人成骨细胞株hFOB 1.19 购自美国ATCC 细胞保藏中心。hFOB 1.19细胞为人胚永生化成骨细胞系，是将SV40 LT 抗原基因转染入自然流产的胎儿组织中使其获得永生化的，与人成骨细胞具有高度同源性，是评价药物影响骨代谢的最佳细胞模型。将细胞培养在Ham"s F12和DMEM 1∶1的混合培养基（含10%胎牛血清）中，常规培养。

1.2 细胞干预及分组 细胞经0.25%胰蛋白酶（上海第一生化药业有限公司生产，规格：2.5万U）消化后，调整细胞密度为 5×103个/ml，每孔 200 μl 种植于 96 孔板中，培养24 h 后吸弃培养液，加入0、1、5、25、50、100、200 和300 μM的Dex（美国Sigma-Aldrich 公司），加入培养基至200 μl，每组设4个复孔，于37℃、5%CO2的培养箱中培养48 h，之后采用MTT法检测细胞增殖率。

为检测ROS 在Dex 影响成骨细胞增殖及凋亡中的作用，我们采用ROS 的清除剂抗坏血酸（AA）和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）处理Dex（广东华南药业集团有限公司生产，规格：075 mg）干预后的成骨细胞，AA 和NAC 均购自美国Sigma-Aldrich 公司。基于此，将 hFOB 1.19 分为 4 组：对照组，Dex 组，Dex+AA 组和 Dex+NAC 组。对照组：不加药物，只培养 48 h；Dex 组：细胞采用 300 μM 的 Dex 处理 48 h。Dex+AA 组：细胞中同时加入 300 μM 的 Dex 及 2 000 μM 的AA，培养 48 h。Dex+NAC 组：细胞中同时加入 300 μM 的Dex及500 μM的NAC，培养48 h。

1.3 细胞增殖率检测 将5×103个/ml密度的细胞以每孔 200 μl 种植于 96 孔板中，细胞干预及分组同 1.2 部分，均以只含有培养基的孔为空白孔。处理48 h 后每孔加入10 μl 的CCK-8 溶液，于37℃孵育 1 h，用酶标仪在450 nm 处 检测 吸 光值（OD）。 细 胞增 殖 率（%）=（OD试验组-OD空白组）/OD空白组×100%。

1.4 细胞凋亡率检测 细胞分组同1.2部分，培养48 h后用 PBS 洗 3 次。然后将 100 μl 的细胞加入至 100 μl 的FITC-Annexin V/PI 检测液中，避光室温孵育30 min。之后采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 ROS 水平检测 细胞分组同1.2 部分，培养48 h后用 PBS 洗 3 次，然后用 10 μM 的 DCFH-DA 于 37℃避光孵育30 min，之后采用流式细胞仪检测平均荧光强度。活性氧检测试剂盒购自上海碧云天公司，严格按照试剂盒操作。

1.6 碱性磷酸酶（ALP）活性检测 细胞分组同1.2 部分，培养 48 h 后。取 10 μl 的细胞加入 96 孔板中，用碱性磷酸酶检测试剂盒（上海碧云天公司）中的显色底物调整体积至50 μl，摇晃均匀，于37℃孵育10 min。之后每孔加入 100 μl的反应终止液，用酶标仪在405 nm 处检测吸光值。ALP 活性单位的定义为：在pH 9.8 的二乙醇胺（DEA）缓冲液中，37℃条件下，每分钟水解对硝基苯磷酸二钠显色底物产生1 μmol对硝基苯酚所需的ALP 的量定义为一个酶活力单位，也称为一个DEA 酶活力单位。ALP 活性（%）=ALP 活性单位给药组/ALP活性单位对照组×100%。

1.7 Western Blot 细胞分组同1.2 部分，培养48 h 后采用RIPA 裂解液提取各组细胞中的总蛋白，BCA 试剂盒对总蛋白定量。将20 μg的总蛋白加入至上样缓冲液中，采用SDS-PAGE 凝胶电泳分离总蛋白，之后将总蛋白转至PVDF膜上。采用3%胎牛血清封闭45 min后，加入一抗，4℃孵育过夜，TBST 洗 3 次。孵育二抗，室温摇床孵育 1 h，TBST 洗3 次。用电化学发光试剂（ECL）于暗室发光。凝胶成像系统和Image J软件收集处理分析条带，GAPDH为内参。

1.8 统计学分析 所有数据采用均数±标准差表示，符合正态分布，数据采用SPSS22.0 软件进行统计学分析。多组建比较采用单因素方差分析，LSD 多重比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Dex对成骨细胞增殖和凋亡的影响 如图1所示，与0 μM 的Dex对比，100 μM、200 μM 和300 μM 的Dex可显著抑制成骨细胞的细胞增殖率（均P＜0.05）。而且Dex 的半抑制浓度（IC 50）约在300 μM，因此我们选择300 μM 的Dex应用于后续的试验。如表1所示，与对照组对比，Dex组细胞的细胞增殖率显著降低（P＜0.05），细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）。与 Dex 组对比，Dex+AA 组和 Dex+NAC 组细胞的细胞增殖率显著增加（P＜0.05），细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）。

2.2 Dex对成骨细胞中ROS和ALP 水平的影响 如表2 所示，与对照组对比，Dex 组细胞的ROS 水平显著增加（P＜0.05），ALP 活性显著降低（P＜0.05）。与 Dex 组对比，Dex+AA组和Dex+NAC组细胞的ROS水平显著降低（均P＜0.05），ALP活性显著增加（均P＜0.05）。

2.3 Dex 对成骨细胞中PI3K 活性的影响 如表3 所示，与对照组对比，Dex 组细胞的p-PI3K 相对表达量和p-PI3K/PI3K 比值显著降低（P＜0.05）。与 Dex 组对比，Dex+AA 组和Dex+NAC 组细胞的p-PI3K 相对表达量和p-PI3K/PI3K 比值显著增加（P＜0.05）。各组间PI3K 相对表达量对比差异无统计学意义。

图1 Dex对成骨细胞增殖率的影响

表1 各组细胞增殖率和细胞凋亡率对比（±s，%）

表1 各组细胞增殖率和细胞凋亡率对比（±s，%）

注：与对照组对比，aP＜0.05；与Dex组对比，bP＜0.05

组别对照组Dex组Dex+AA组Dex+NAC组F值P值细胞增殖率100.00±1.76 51.47±5.62a 89.32±6.74b 94.58±5.01b 44.82＜0.001细胞凋亡率3.71±1.16 18.42±3.19a 9.68±2.23ab 8.97±2.07ab 28.61＜0.001

表2 各组细胞中ROS和ALP水平对比（±s）

表2 各组细胞中ROS和ALP水平对比（±s）

注：与对照组对比，aP＜0.05；与Dex组对比，bP＜0.05

组别对照组Dex组Dex+AA组Dex+NAC组F值P值荧光强度1.49±0.37 4.40±1.08a 2.05±0.61b 1.96±0.43b 14.68 0.003 ALP活性（%）100.00±0.83 69.71±7.53a 85.49±8.17ab 92.55±8.01b 14.09 0.002

表3 各组细胞中PI3K活性对比（±s）

表3 各组细胞中PI3K活性对比（±s）

注：与对照组对比，aP＜0.05；与Dex组对比，bP＜0.05

组别对照组Dex组Dex+AA组Dex+NAC组F值P值PI3K相对表达量0.57±0.13 0.62±0.16 0.63±0.11 0.59±0.14 0.16 0.92 p-PI3K相对表达量0.98±0.17 0.26±0.08a 0.76±0.12b 0.80±0.12b 23.76＜0.001 p-PI3K/PI3K 1.72±0.35 0.43±0.10a 1.21±0.27b 1.35±0.21b 18.89＜0.001

2.4 Dex 对成骨细胞中AKT 活性的影响 如表4 所示，与对照组对比，Dex 组细胞的p-AKT 相对表达量和p-AKT/AKT 比值显著降低（P＜0.05）。与Dex 组对比，Dex+AA 组和Dex+NAC 组细胞的p-AKT 相对表达量和p-AKT/AKT 比值显著增加（P＜0.05）。各组间AKT 相对表达量对比差异无统计学意义。

表4 各组细胞中AKT活性对比（±s）

表4 各组细胞中AKT活性对比（±s）

注：与对照组对比，aP＜0.05；与Dex组对比，bP＜0.05

组别对照组Dex组Dex+AA组Dex+NAC组F值P值AKT相对表达量0.85±0.21 0.86±0.19 0.88±0.23 0.94±0.16 0.16 0.92 p-AKT相对表达量0.56±0.10 0.19±0.06a 0.38±0.11b 0.42±0.08b 11.61 0.007 p-AKT/AKT 0.66±0.19 0.21±0.08a 0.45±0.04b 0.45±0.07b 11.04 0.001

2.5 Dex 对成骨细胞中GSK3β 活性的影响 如表5 所示，与对照组对比，Dex 组细胞的GSK3β 相对表达量、p-GSK3β 相对表达量和 p-GSK3β/GSK3β 比值均显著增加（P＜0.05）。与Dex 组对比，Dex+AA 组和细胞的 p-GSK3β相对表达量和p-GSK3β/GSK3β 比值显著降低（P＜0.05），GSK3β相对表达量无显著变化。

表5 各组细胞中GSK3β活性对比（±s）

表5 各组细胞中GSK3β活性对比（±s）

注：与对照组对比，aP＜0.05；与Dex组对比，bP＜0.05

组别对照组Dex组Dex+AA组Dex+NAC组F值P值GSK3β相对表达量0.18±0.05 0.37±0.06a 0.31±0.08 0.30±0.06 6.29 0.008 p-GSK3β相对表达量0.12±0.04 0.49±0.09a 0.26±0.05ab 0.22±0.07b 22.92＜0.001 p-GSK3β/GSK3β 0.67±0.15 1.32±0.24a 0.83±0.19b 0.73±0.16b 9.87 0.002

3 讨 论

骨坏死是一种严重的退化性骨疾病，与成骨细胞凋亡有关［1］。成骨细胞是一种骨形成细胞，在骨生成和预防骨坏死中起关键作用［8］。GCs 的使用已成为骨坏死的最常见原因［3］。先前的研究已经证明，Dex对成骨细胞具有抑制作用，原因与其对成骨细胞的细胞增殖和细胞凋亡的作用有关［9］。在本研究中，我们发现100 μM、200 μM 和300 μM 的Dex 作用48 h 可显著抑制成骨细胞hFOB 1.19 的细胞增殖，且 Dex 的 IC 50 约在 300 μM，因此我们选择 300 μM 的 Dex应用于后续的试验。结果还发现，300 μM 的Dex 作用48 h可显著促进成骨细胞的凋亡。这些结果及研究均表明，Dex可抑制成骨细胞的增肌，并促进其凋亡。

过量的ROS 在诱导各种细胞凋亡中具有重要的作用［10］。过量的 ROS 产生将导致细胞内 ROS 压力增加，然后破坏细胞中的脂质、蛋白质和DNA 的结构和功能，从而通过线粒体介导的caspase 凋亡途径导致细胞凋亡［11］。Sato AY等［7］的研究证明ROS应激的增加参与Dex诱导的成骨细胞OB-6 凋亡。在研究中，我们发现Dex 可显著增加成骨细胞中ROS的水平约3倍，推测这可能是Dex诱导成骨细胞凋亡的机制。因此之后我们采用ROS 的清除剂NAC 或AA 与Dex 同时处理成骨细胞，结果表明NAC 或AA 均可降低Dex诱导的ROS 的产生，验证了NAC 或AA 对ROS 的清除效果。此外，我们还发现NAC或AA可增加Dex诱导的成骨细胞增殖，并抑制Dex 诱导的成骨细胞凋亡。这些结果进一步证实，Dex 对成骨细胞的促凋亡作用是通过过量ROS 的产生介导的。

ALP 可使局部钙、磷的浓度升高，并在胶原原纤维内沉积，对矿物质化机制的进行具有有利的作用，是促进骨间质矿化的重要酶。目前认为ALP活性是反映成骨细胞成熟状态的重要标志之一［12］。本研究结果显示，与对照组对比，Dex 组细胞的ALP 活性显著降低。与Dex 组对比，Dex+AA组和Dex+NAC 组细胞的ALP 活性显著增加。这些结果表明，Dex 可降低成骨细胞的活性，而在Dex 诱导的成骨细胞中加入ROS 清除剂后可显著增加成骨细胞的活性，进一步表明ROS在Dex抑制成骨细胞活性中的重要作用。

目前已经发现磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶3（PI3K/AKT）信号通路参与细胞增殖、分化、侵袭和凋亡相关的多种信号转导通路［8］。Ma P 等［13］的研究指 PI3K/AKT 信号通路的激活是大鼠成骨细胞增殖和分化的必要条件。在本研究中，我们还发现Dex 处理可下调成骨细胞hFOB 1.19 中p-PI3K 和 p-AKT 的表达，而 NAC 或 AA 可逆转 Dex 诱导的成骨细胞中PI3K/AKT 信号通路的失活。这些结果证实了Dex 通过抑制PI3K/AKT 信号传导途径诱导成骨细胞凋亡，并且ROS 应激的增强在Dex 诱导成骨细胞中PI3K/AKT 信号通路的失活中起重要作用。

糖原合成酶激酶3β（GSK3β）最初被认为是糖原代谢的调节剂［14］。GSK3β 是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，可以调节能量代谢、细胞生长和细胞凋亡［15］。此外，GSK3β是PI3K/AKT 的关键下游底物和效应子［16］。在我们的研究中发现，Dex 可增加成骨细胞中 GSK3β 的活性，而 NAC 或 AA可逆转Dex诱导的成骨细胞中GSK3β 活性的增加。由于已经表明GSK3β是PI3K/AKT的关键下游底物，因此我们可以得出结论，Dex 通过PI3K/AKT/GSK3β 信号通路促进成骨细胞凋亡，并且ROS在其中起重要的调控作用。

本研究还具有一些不足之处，例如缺少动物实验的活体内研究，以及并未做信号通路的阻断实验等等，这些将是下一步研究要解决的问题。

总之，本研究表明Dex 可通过ROS-PI3K/AKT/GSK3β信号通路诱导成骨细胞凋亡，并建议ROS 可能是Dex 诱导的成骨细胞凋亡的治疗或预防靶标。另外，仍需进一步的体内研究以验证本研究中的发现。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。