冯湘沅，许炳荣，成莉凤，杨琦，刘平，刘志远，郑科，段盛文*，彭源德*

（1.中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205；2.湖州南浔善琏盛业纺织有限公司，浙江 湖州 313014）

21世纪以来，随着社会的进步和生活水平的提高，人们对服装的要求更加注重纺织材料的健康环保和绿色天然，而罗布麻韧皮正是一种健康、天然、绿色的纺织原料［1］。

由于罗布麻韧皮含有半纤维素、果胶、木质素等胶质，必须去除胶质才能用于纺织，但罗布麻与苎麻、亚麻等韧皮相比，含有的黄酮类、槲皮苷、强心苷、酚类、丹桂酸等诸多抑菌成分较多，相较其他麻类植物脱胶难度较大［2-4］。为了改善这一问题，近年来，国内外科学研究者开展了大量工作。例如申请号为201010530013.1的中国专利公开了一种罗布麻韧皮纤维短流程脱胶方法，首先将罗布麻韧皮浸入配制的松解液中进行松解，然后再加入一定量的碱进行煮炼，最后洗涤得到目标物质，该方法虽然缩短了生产时间，提高了工作效率，但是采用碱法处理，使得纤维受到碱类不同程度的破坏，从而导致产物得率很低［5］。Halim等［6］研究了一种以乙酸浸泡为核心的罗布麻脱胶工艺。而生物脱胶主要依赖于产果胶酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等活性高的优良菌株，在适当条件下将非纤维素物质快速降解为低分子单糖类物质，从而实现脱胶目的，具有可循环和环保的优点［7-8］。

本研究拟分别采用0.1%氨水和自来水为浸泡液，并利用LM菌株在恒温振荡条件下对罗布麻韧皮进行脱胶，检测脱胶过程中发酵液的关键酶活力、pH值、有机酸组分浓度的变化规律，以及脱胶试验终止时的单糖类组分含量、脱胶失重率等指标，旨在寻找一种适合于罗布麻韧皮脱胶的方法，并为其脱胶机理提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

LM菌株：菊果胶杆菌变异菌株Pectobacteriumchrysanthemi（保藏号CCTCCM 2017304）。

原麻：罗布麻韧皮。

液体培养基：氯化钠0.5%，葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，牛肉浸膏0.5%，自来水。

1.2 主要仪器与试剂

液相色谱仪（Dionex Ultimate 3000），紫外检测器（VWD-3400），Thermo Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），图谱和数据采集处理为变色龙软件。

粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司，FZ102型），恒温振荡器（金坛市天竟实验仪器厂，SHZ-82型），pH计（梅特勒-托利多仪器上海有限公司，FE28型），全波长酶标分析仪（Thermo Fisher，multiskan Go型）。

葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、橘子果胶、木聚糖均为美国Sigma公司产品；

乙酸铵（分析纯）、1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮（PMP）、乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、三氯甲烷、氨水、3，5-二硝基水杨酸、丙三醇均为国药集团化学试剂有限公司产品；甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、磷酸二氢钾、乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）均为Aladdin公司产品；魔芋胶为成都路特生物技术有限公司产品。

0.1%氨水浸泡液：V（氨水）∶V（自来水）=0.1∶100。

DNS试剂：称取3，5-二硝基水杨酸6.5 g，溶于约500 mL超纯水中，逐渐加入325 mL的氢氧化钠（2mol/L）溶液，45℃水浴中搅拌（磁力），再加入45 g丙三醇，待全部溶解后，冷却至室温，定容至1000 mL，贮存于棕色试剂瓶中，暗处放置7 d后使用。

1.3 菌液制备

挑取LM菌株的活化典型菌落1个接入盛有5 mL液体培养基的培养瓶中，混匀，置于35℃、150 r/min恒温振荡器培养4 h后，全部倒入盛有100mL液体培养基的培养瓶中，继续培养5 h后，再取6 mL接于300 mL液体培养基的培养瓶中培养6 h。

1.4 接种与脱胶

取6 mL菌液于装有300 mL氨水（0.1%）浸泡液（根据前期预试验确定0.1%氨水为最适体积百分比浓度）的锥形瓶中，混匀，投入15 g罗布麻韧皮，置于35℃、150 r/min全恒温振荡器进行振荡，同时设置CK组（加菌、自来水）。

1.5 取样

罗布麻韧皮接种振荡0.5 h开始取样，直至15.5 h结束，其中每隔3 h取样一次。每瓶取10 mL（立即用等量无菌水补充）发酵液，分别用于测定关键酶活力、pH值、有机酸浓度等指标；试验终止时的发酵液用于测定单糖类含量；麻纤维用于测定脱胶失重率。

1.6 测定方法

1.6.1 关键酶活力测定

果胶酶活力的测定［9］：取2.0 mL果胶酶底物（0.05 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH 9.0，配置5.0 mg/mL聚半乳糖醛酸钠溶液，预热至50℃），加入1.0 mL粗酶液（0.2μm滤膜过滤发酵液所得的过滤液），50℃下反应5 min后，立刻加入2.0 mL DNS，沸水浴显色5.0 min，冰浴冷却，加入超纯水定容至15 mL。以灭活的粗酶液作阴性对照，在520 nm波长测定OD值。

甘露聚糖酶活力的测定［10］：底物改为0.05 mol/L柠檬酸-0.1 mol/L磷酸氢二钠缓冲液（pH=6.0）配置5.0 mg/mL的甘露聚糖溶液，预热至65℃，剩余步骤与果胶酶活力测定一致，在540 nm波长测定OD值。

木聚糖酶活力测定［11］：底物改为0.05mol/L柠檬酸-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH=5.8）配置5.0 mg/mL的木聚糖溶液。预热至60℃，剩余步骤与果胶酶活力测定一致，在540 nm波长测定OD值。

1.6.2 有机酸组分测定

有机酸组分含量参照冯湘沅等［12］的HPLC法进行测定。

混合标准有机酸溶液配制：用超纯水准确配制浓度5 g/L甲酸、5 g/L乙酸、5 g/L乳酸、5 g/L丙酸的标准溶液，分别取上述等体积各标准溶液混合，0.45μm滤膜过滤，适度稀释用作HPLC检测分析。

样品处理：取发酵液2 mL，10 000 r/min离心10 min，去沉淀，取上清用0.2μm滤膜过滤，HPLC检测分析。

HPLC检测条件：流动相：V（甲醇）∶V（0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液，pH2.7）=3∶97；紫外检测波长：210 nm；柱温：25℃；流速：0.6 mL/min；进样量：20μL。

1.6.3 pH值测定

取2 mL发酵液按照pH计操作说明书测其pH值。

1.6.4 单糖类测定

单糖类含量测定按照冯湘沅等［13］的方法进行。

HPLC检测条件：流动相：V（乙腈）∶V（0.1mol/L醋酸铵缓冲，pH5.5）=19∶81；紫外检测波长：250 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样量：20μL。

1.6.5 失重率测定

试验终止时，将麻瓶置于灭菌高压锅中保持105℃、20 min，取出麻纤维，然后用清水洗掉附着在纤维表面的胶质（注意防止纤维损失），干燥、称量。

脱胶失重率以质量百分数w（%）表示，按公式（1）进行计算：

式中：

m0—试验初始麻皮质量，g；

m1—试验终止麻纤维质量，g。

2 结果与分析

2.1 脱胶过程中关键酶活力变化规律

处理组（0.1%氨水浸泡液）和CK组（自来水浸泡液）的果胶酶活力（图1，a）均随发酵时间的延长先升高后降低，但两组浸泡液达到最大酶活力所需时间和增加的幅度却不同，处理组、CK组果胶酶达到最大酶活力分别为12.5、9.5 h。处理组果胶酶由起始酶活力（28.77 U/mL）到最高酶活力（674.4 U/mL）增加了645.63 U/mL，而CK组果胶酶活力却只增加了301.40 U/mL。

处理组、CK组甘露聚糖酶活力（图1，b）均随发酵时间的延长而逐渐升高，但CK组酶活力增长的幅度明显低于处理组。从0.5 h开始到15.5 h结束，处理组甘露聚糖酶活力由起始测定时的10.97 U/mL上升到脱胶结束时的113.69 U/mL。而CK组在整个脱胶过程中甘露聚糖酶活力最大值仅为29.15 U/mL。

处理组、CK组的木聚糖酶活力（图1，c）均随发酵时间的延长呈上升趋势，但处理组木聚糖酶活力较CK组增加明显。15.5 h发酵终止时处理组的酶活力（42.14 U/mL）较CK组（10.06 U/mL）提高32.08 U/mL。

图1 脱胶关键酶活力变化规律Fig.1 Variation trend of activities of the key enzymes for degumming

由脱胶关键酶活力变化规律发现，以0.1%氨水作为罗布麻韧皮脱胶浸泡液，可能会为LM菌株提供充足的氮源，有利于菌株的快速大量生长繁殖，从而使脱胶关键酶的分泌量增加。

2.2 脱胶过程中发酵液有机酸组分变化规律

通过对罗布麻韧皮脱胶过程中采集的样品进行适当稀释，经HPLC法分析得到发酵液中含有甲酸、乳酸、乙酸、丙酸等有机酸组分，从图2、3可看出：

图2 处理组有机酸组分变化规律Fig.2 Variation trend of organic acids in treatment group

图3 CK组有机酸组分变化规律Fig.3 Variation trend of organic acids in control group（CK）

处理组、CK组甲酸浓度的变化规律近乎相同，均为0.5～6.5 h缓慢上升，6.5～12.5 h出现下降，12.5～15.5 h又回升，变化趋势均大致呈“N”型，但在脱胶过程中，处理组甲酸浓度均高于CK组。

处理组的乙酸浓度出现“M”不规则型变化趋势，在3.5、12.5 h出现峰高，浓度分别为0.54、0.46 mg/L；CK组仅在9.5 h出现峰高，浓度为0.50 mg/L，呈倒“V”型变化趋势。

处理组乳酸浓度的变化趋势大致为“M”型，起始浓度（0.04mg/L）低于终止浓度（0.05mg/L）。

CK组的乳酸浓度近似于“N”型的变化趋势。

处理组的丙酸浓度为“W”型的变化趋势，峰高分别在0.5 h（0.17 mg/L）、6.5 h（0.15 mg/L）、15.5 h（0.09 mg/L）出现；CK组的丙酸浓度大致呈倒“V”型，6.5 h出现最大含量（0.13 mg/L）。

脱胶过程中有机酸组分变化规律显示，在发酵初期，由于LM菌株利用原料溶出物进行生长繁殖、分泌脱胶关键酶，产生代谢释放乙酸和乳酸，导致其浓度逐步上升，随着发酵时间的延长，菌株进入稳定生长期，乙酸与乳酸转化速度趋于平稳，同时乙酸与乳酸在其他微生物（杂菌）作用下逐步被还原利用，致使浓度下降，随后其他微生物也开始大量繁殖，代谢产生的乙酸和乳酸转化速度大于消耗速度，浓度再次回升，直至微生物进入衰亡期后，乙酸和乳酸的转化速度又小于消耗速度，浓度再次下降。甲酸浓度变化规律与乙酸和乳酸近乎相同，也经历了先升高、再降低、又升高的变化过程，但是甲酸浓度变化幅度较小、周期较长。丙酸浓度一开始就出现下降，可能是原料中含有某种能降解丙酸的微生物，之后随着LM菌株的快速生长代谢，致使原料溶出物逐渐转化成丙酸而浓度升高，LM菌株进入稳定期后，其他可利用丙酸的微生物进一步生长，丙酸浓度下降，直至最后微生物进入衰亡期，丙酸进一步累积［14-16］。通过比较发现，处理组所积累的有机酸组分变化趋势较CK组明显增强，表明添加一定量的氨水浸泡液能使LM菌株在罗布麻韧皮脱胶过程中代谢活动更加旺盛。

2.3 脱胶过程中发酵液pH值变化规律

如图4所示，处理组在0.5～9.5 h，发酵液pH值由9.15下降到7.06，15.5 h时发酵液pH值上升到7.65，整个脱胶过程中发酵液pH值呈略似于“V”字型的变化规律。这可能是由于处理组在加入0.1%氨水后浸泡液初始pH值大幅度增加，随着发酵时间的增加，LM菌株在脱胶过程中产生代谢活动。从整个发酵体系来看，发酵液pH值处于7.06～9.15，这一环境能促使菌株不断地消耗发酵液中溶氧及溶出物，快速分泌脱胶关键酶，从而使发酵液中形成的乙酸、乳酸等有机酸被逐一分解和转化［17］，导致发酵液pH值降低或回升。而CK组的发酵液pH值随着发酵时间的延长变化不大，此环境不利于LM菌株脱胶关键酶的产生，代谢活动欠佳，其pH值在5.3上下波动。

图4 pH值变化规律Fig.4 Variation trend of pH values

2.4 单糖类含量分析

罗布麻韧皮分别在两组浸泡液下加菌进行恒温振荡发酵15.5 h时，取发酵液经浓缩、干燥后，用HPLC法检测单糖类组分含量，结果如图5、表1所示。对照单糖类标准曲线可以看出，处理组发酵液的半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖含量依次为1.93、0.87、0.86、2.36 mg/g，其含量分别为CK组相应含量的5.4、2.5、4.1、5.4倍，但甘露糖、鼠李糖含量相差不大。结果表明，浸泡液中添加一定量的氨水可能有利于破坏罗布麻韧皮中的木质素结构［18-19］，能促进脱胶关键酶与罗布麻韧皮中的半纤维素、果胶等成分充分接触，从而将罗布麻韧皮中的果胶降解为半乳糖醛酸，半纤维素降解成甘露糖、半乳糖、鼠李糖、木糖等单糖类物质，更好地起到协同脱胶作用。

图5 罗布麻韧皮发酵液的单糖类组分色谱图Fig.5 Liquid chromatogram of monosaccharides from A.venetum bast fermentation broth

表1 罗布麻韧皮发酵液的单糖类组分含量Table 1 Content of monosaccharide in fermentation broth of A.venetum bast

2.5 失重率分析

试验终止时，麻纤维经灭活、干燥、称量，按照公式（1）计算失重率得出的结果如图6所示，CK组、处理组的失重率分别为20.02%、29.13%，处理组的失重率较CK组提高了9.11%。这更进一步表明处理组剥离非纤维素物质能力较CK组强。

图6 罗布麻韧皮失重率Fig.6 Weight loss rate of A.venetum bast

3 结论

本研究分别以0.1%氨水（处理组）和自来水（CK组）为浸泡液，加入LM菌液和罗布麻韧皮在35℃、150 r/min条件下进行振荡脱胶比较，结果表明：采用0.1%氨水浸泡液能使LM菌株对罗布麻韧皮脱胶过程中所分泌的甘露聚糖酶、果胶酶、木聚糖酶的增加幅度较CK组分别相应提高4.8、2.5、7.5倍；代谢活动所产生的有机酸组分——甲酸、乳酸、乙酸、丙酸浓度变化趋势较CK组增强；发酵液pH值在7.06～9.15，而CK组pH值处于5.3上下波动；试验终止时发酵液中半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖含量分别是CK组相应含量的5.4、2.5、4.1、5.4倍；脱胶失重率较CK组提高9.11%。研究发现，以0.1%氨水为浸泡液能使LM菌株更好地完成罗布麻韧皮脱胶。

由于以自来水为浸泡液的发酵液呈较强酸性，对微生物生长繁殖、分泌脱胶关键酶所需条件不利，故本研究通过氨水来提高浸泡液起始pH值，进而补充氮源，使LM菌株对罗布麻韧皮起到一定的脱胶效果。但是氨水具有较强烈的刺激性气味以及不稳定性特征，因此，结合添加最佳缓冲液实现高效脱胶菌株对罗布麻韧皮的脱胶还有待于进一步探究。