马永红，朱四元，严理，刘头明

（中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205）

小RNA（miRNA）是一段长22 bp左右、具有颈环结构的小分子非编码RNA，其在生物体内含量较rRNA、tRNA、mRNA等主要RNA要低得多。miRNA虽然不编码蛋白，但具有转录因子的作用，通过多种酶的剪切加工作用形成成熟的miRNA沉默复合体后，通过碱基互补配对靶向沉默mRNA，抑制靶基因的翻译或靶向降解靶基因，进而调控植物的生长发育［1-7］、逆境胁迫［8-9］等多种生物过程。例如miR319调控靶基因TCP4在拟南芥中的表达，miR319表达下调会使TCP表达量上升，促进了次生壁细胞的合成，筛管增厚［10］。在番茄中，miR319的过表达下调了几个TCPs基因，导致小叶变大，叶片边缘持续生长，而miR319表达水平的降低或TCP表达水平的提高会使番茄叶片变小。在柑橘中，miR397通过调控LAC基因调节细胞壁多糖的二次沉积，调控细胞壁的形成［11］。对于miRNA的研究引起生物学界广泛关注。

苎麻（BoehmerianiveaL.Gaud）是一种多年生草本植物，具有宿根性，纤维含量丰富，早期通过抽取纤维制作麻绳等，是中国主要的纺织纤维作物，具有悠久的种植历史。苎麻作为重要的天然纤维作物，其产量决定因素在于韧皮部，韧皮纤维次生壁的生物合成决定纤维产量。纤维素合成酶是植物纤维合成的关键酶，基于转录组序列，Liu等［12］发现苎麻中36个可能与韧皮纤维发育相关的纤维素合成酶基因。miRNA也可能参与了苎麻的韧皮纤维发育调控。Wang等［13］构建了苎麻纤维伸长、胞壁增厚和端壁溶解阶段miRNA表达谱，并在纤维伸长增厚和端壁溶解阶段识别到298个miRNA，推测他们可能与苎麻的纤维发育相关。在拟南芥、水稻、柑橘等中也有关于miRNA调控纤维发育功能的报道，如在拟南芥中，miR397b通过调控其靶基因AtLAC4的表达进而影响木质素的含量，miR397b过表达株系木质素含量降低，次生壁厚度变薄［14］。在陆地棉中，调控纤维发育的GhLAC4基因与miR397b的碱基互补区域发生了mRNA的切割，也说明了miRNA对棉花纤维发育的调控作用［15］。研究表明，具有较高同源性的基因在不同植物体中可能具有不同的生物学功能，例如mir397a在番茄中主要参与非生物胁迫过程［16］，而在梨果肉中主要调控石细胞的发育形成［17］。在苎麻中关于纤维发育的miRNA研究较少，所以本研究拟针对苎麻茎皮进行miRNA测序，并进行表达分析，以研究和发现苎麻中可能与纤维发育相关的miRNA，旨在为阐明miRNA在苎麻纤维发育中的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料处理

苎麻材料为中苎1号，取自中国农业科学院麻类研究所试验基地，所取材料均经过清水冲洗，取叶（中部叶）、5芽（顶端芽）、顶皮（顶端韧皮部）、中皮（中间韧皮部）、茎（中间木质部）、根（根尖）6个部位迅速转入液氮后移至-80℃冰箱中保存备用，以防止RNA降解。

1.2 RNA提取及RNA纯度、产率和完整性检测

将0.5 g苎麻组织在液氮中迅速研磨至粉末状，按照植物RNA提取试剂盒说明书（Takara）的要求提取RNA，-80℃保存。苎麻根部含有大量多糖多酚类物质，在研磨样品后按说明书提取方法二（去除多糖多酚法）进行操作。

取1μL RNA样品，用微量分光光度计（NANO 100，中国）测其A260/A280和A260/A230的比值和RNA浓度。取所得的RNA约2μL，加2μL无RNAase的水和1μL 6×loading buffer后制备1.0%的琼脂凝胶，在1×TBE缓冲液中电泳检测总RNA的完整性。

1.3 反转录及qRT-PCR体系的建立

分别取苎麻6个部位RNA 1μg，按照cDNA合成试剂盒（TransgenAT311）上的说明书操作进行反转录。反应体系为 20μL，反应条件：30°C 10min，42°C 20min，95°C 5min，反转录完成后再加无菌水稀释5倍至100μL。反转录后的cDNA置于-80℃冰箱保存。

1.4 miRNA测序以及内参基因的选择

对中苎1号苎麻中韧皮部进行miRNA的提取、文库构建和高通量测序，对miRNA测得的原始数据需进行质量控制，得到高质量序列，为了识别miRNA，将miRNA序列中的优质数据分别采用AASRA［18］和 CMsearch软件［19］与 miRbase［20］和 Rfam［21］数据库进行比对。通过使用 PIPmiR［22］和默认参数，未匹配到这两个数据库的序列被认为是新的miRNAs。与已知miRNA数据库miRBase（v21）中的成熟miRNA序列进行比对，完全相同的序列被认为是已知miRNA。

所选内参基因要具有稳定表达的特性，且与要定量的基因表达量相近，为了获得可靠的qPCR结果，必须为每个研究物种和需要定量的基因选择合适的内参基因［23］。内参基因的稳定性取决于样本和条件，因为苎麻没有完善的qPCR内参设定体系，因此从常用作内参的管家基因中选择18s、ACT、TUB、UBQ4个基因。设计引物，凝胶电泳检测引物设计是否合适，然后进行qPCR检测。

在NCBI中查找测序鉴定到的候选基因的保守序列，用Primer 5.0软件设计引物（表1）。引物的退火温度为53～57°C，引物长度为18～21 bp，扩增产物长度为150～250 bp。引物序列由擎科生物有限公司合成，实时定量PCR使用的引物见下表1。

表1 qRT-PCR检测中基因的引物序列Table 1 Primer sequences of genes in qRT-PCR analysis

1.5 纤维发育相关miRNA的靶基因测定

miRNA为具有负调控作用的转录因子，其所调控的靶基因才可能具有实际调控纤维发育的作用，为了进一步阐明miRNA调控纤维发育的生物学机制，取苎麻韧皮部转录本进行测序，构建RNA文库并进行高通量测序，根据miRNA与靶基因碱基互补配对高度的保守性进行具有差异表达的miRNA的靶基因预测。常用的靶基因预测软件有TAPIR［24］和TargetFinder［25］，参数设置为默认参数。

1.6 实时荧光定量

PCR试剂采用Transgen公司的荧光定量PCR试剂盒，采用SYBRGreen荧光染料法在CFX96实时荧光定量PCR仪上进行定量。按照说明书进行操作，选取管家基因18s为内参基因。PCR体系按照TB GreenPremix酶（Transgen公司）说明书的要求设置，对6个部位进行3次生物学重复，体系为20μL，扩增程序95℃预变性3 min，40个循环的程序为95℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s。

1.7 数据处理

采用Excel进行数据统计和分析，CFX96分析软件制作扩增曲线。用BestKeeper软件分析内参基因表达的稳定性。相对表达量的计算以18s为内参基因，计算Ct值（Ct代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数），参照魏敏［26］计算方法，得到RQ值（表达量变化倍数）。即通过计算 ΔCt（ΔCt=Ct目的基因-Ct内参），获得 ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCt（实验组）-ΔCt（对照组），再计算RQ值（RQ=2-ΔΔCt），取3次生物学重复的平均值作为该基因在该处理组的表达量，并计算RQ的误差。

2 结果与分析

2.1 苎麻中的miRNA测序

通过对苎麻韧皮部miRNA的测序，在苎麻韧皮部共计378个miRNA中，将测序序列进行注释，共鉴定出176个已知miRNA和202个新miRNA，为了研究miRNA在苎麻不同部位是否具有表达差异，选定了3个在模式生物中同源且与纤维发育相关的常见miRNA进行了实时定量PCR检验，分别为miR828、miR166和miR156。

2.2 纤维发育相关miRNA的靶基因预测

通过与拟南芥同源序列对比发现有许多和拟南芥一致的靶标，如HDZIP基因、MYB基因、NAC基因等，被miRNA（分别为miR166、miR828、miR156）靶向调控，具体见表2。而拟南芥中的HDZIP基因、MYB基因、NAC基因具有调控纤维发育的功能，由于miRNA具有反向调控靶基因表达的作用，通过抑制靶基因的表达调控植物生长发育。在拟南芥纤维发育过程中，茎顶端miRNA基因的表达量高，从而抑制靶基因的程度也高，在茎中部，miRNA基因表达量降低，使靶基因表达量上升，从而引起次生壁细胞发生增厚或增多，茎秆增粗，纤维量增加［27］。推测在苎麻中miRNA表达也具有这种规律性。

表2 miRNA靶基因功能注释Table 2 Functional annotation ofmiRNA target genes

2.3 苎麻内参基因的分析

对4对候选内参基因18s、ACT、TUB和UBQ进行测试，Ct值在6～37，表达丰度分布范围较广（图1）。由此可初步判断，18s和ACT表达较为稳定，TUB和UBQ表达差异较大。通过比较两个基因的变异系数（coefficient of variation，CV）和平均标准偏差（standard deviation，SD）来确定基因的稳定性［28］。一般稳定的内参基因具有较低的SD值和CV值。而SD的临界值为1.5，若SD＞1.5，则表明稳定性较差［29］。但是在对目标基因进行校准时，不仅要求所用内参基因的表达水平稳定，而且要求其稳定的表达，与目标基因的表达量相近，表达量过高或过低，都可能导致定量结果出现明显偏差［30］。由表3可知，18s在不同部位中表达量较为稳定，为了保证试验的准确性，选定18s作为标准内参，取相对变量。

图1 苎麻内参基因的Ct值分布Fig.1 Distribution of Ct values of reference genes in ramie

表3 4个候选内参基因在苎麻不同部位的表达稳定性Table 3 The expression stability of 4 candidate internal reference genes in different tissues of ramie

2.4 miRNA中miR156、miR166和miR828的表达分析

对miR156、miR166和miR828进行定量分析，得到溶解度曲线见图2，采用表达量变化倍数（RQ值）对3个mirRNA基因在中苎1号不同部位的表达情况进行分析。以中苎1号根的表达量作为对照，设定表达量为1。由图3可知，miR828、miR166和miR156在顶皮和芽中表达量较高，miR828在芽中表达量最高，miR166其次，miR156最低。miR828、miR166和miR156在顶端韧皮部中表达量高，miR828表达量最高，miR156其次，miR166最低。miR828、miR166和miR156在苎麻的叶、茎和根中表达量均较低。

图2 苎麻中miR828、miR166和miR156扩增曲线Fig.2 Amplification curves of miR828，miR166 and miR156 in ramie

图3 候选基因在中苎1号不同部位的相对表达量Fig.3 The relative expression levels of candidate genes at different sites of Zhonghu No.1

2.5 纤维发育相关miRNA鉴定

将miRNA在顶皮和中皮两个部位进行定量表达见图4，由图4可以看出，3个miRNA在顶皮中的表达量要显著高于中皮，也进一步证明其与苎麻纤维发育相关。

图4 miRNA在顶皮和中皮的表达差异Fig.4 Expression differences of miRNA in the apical and mesothelial

苎麻顶端韧皮部与中间韧皮部中的纤维发育差异明显，中皮纤维处于生长期，次生壁处于正在加厚或增厚结束时期，而顶皮纤维处于刚开始生长期，纤维发育相关基因的表达必定活跃。

3 结论与讨论

本研究在苎麻中共检测到378个miRNA，其中包括176个已知miRNA和202个新miRNA。Wang等［31］对苎麻纤维发育茎皮中miRNA的表达谱进行了表征，得到51个具有差异表达的miRNA。可见，本研究中识别的miRNA数量上更加全面和丰富。在所选的4个管家基因中，18s在苎麻各个部位都能够稳定表达，建议在苎麻研究中作为内参基因。在测定的378个miRNA中选取的3个miRNA经实时定量PCR鉴定，在韧皮部顶端和中部具有差异表达。而顶端韧皮和中部韧皮主要存在纤维发育方面的差距。在模式植物拟南芥中miRNA具有调控纤维发育的作用，如miR319可以通过靶向调控TCP4转录因子激活次生壁的生物合成。miR319过表达导致茎中TCP4丰度降低和次生壁的形成，表明miR319介导TCP4发育过程中次生细胞的生物合成［32］。据此，推测苎麻中miRNA具有调控纤维发育的作用。

在拟南芥的纤维组织中，Yang等［33］发现MYB26过表达会引起木质素的异位沉积，导致表皮纤维组织次生增厚。并发现在两个NAC结构域基因NAC次生壁促因子1（NST1）和NST2的表达也发生了变化，这两个基因与花药内膜的次生增厚有关。NAC基因作为MYB26基因的上游基因，共同调控了纤维组织次生壁的增厚。拟南芥基因组包含47个HDZIP基因，具有调控纤维发育的作用。薛宇［34］比较不同发育时期棉纤维的表达谱深度测序数据，发现大量HD-Zip家族基因可能参与棉纤维发育过程。这说明MYB、NAC和HDZIP在纤维发育中具有重要调控作用。

在本研究中，通过生物信息学预测miR166、miR828和miR156分别靶向调控MYB、NAC和HDZIP基因。通过对比拟南芥同源序列发现，具有纤维发育相关的HDZIP基因、MYB基因、NAC基因的同源基因被miRNA（分别为miR166、miR828、miR156）靶向调控。一般来说，如果预测的靶基因具有调控苎麻纤维发育的作用，那么茎顶端miRNA基因的表达量高，从而抑制靶基因的程度也高，在茎中部，miRNA基因表达量降低，会使靶基因表达量上升，从而会引起次生壁细胞发生增厚或增多，茎秆增粗，导致苎麻纤维量增加。而HDZIP基因、MYB基因［35］和NAC基因在拟南芥等模式生物中对纤维发育的调控作用已被证实。MYB作为一类转录因子广泛参与木质部中木质素、细胞壁的合成。这说明miR166、miR828、miR156可能通过调控MYB、NAC和HDZIP基因来进一步参与到苎麻纤维发育的生物网络中去。本研究只对miRNA在苎麻不同部位的表达进行了定量分析，表明miRNA可能通过调控相关基因表达来调控苎麻纤维发育。对于以上推测需要对预测靶基因的表达量开展进一步的研究。因此，本研究为探究miRNA在苎麻纤维发育调控中的功能奠定了基础。