李 芬,杨金荣，武 坤 综述，曾 云 审校

(昆明医科大学第一附属医院血液科/云南省血液病研究中心 650032)

血友病是凝血因子缺乏导致的遗传性出血性疾病，包括血友病A(HA)和血友病B(HB)[1]。男性HA的发病率约为1/5 000。HA是由位于X染色体上凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因突变或缺失导致的FⅧ功能缺陷，占血友病的80%～85%[2]。血友病的特点是反复出血，主要发生在关节和肌肉中，随着时间的推移，关节出血造成软骨和骨骼损伤，最终导致关节病变。

目前FⅧ替代治疗是血友病唯一有效的治疗方法。HA的治疗过程中，会产生抗FⅧ的中和抗体(抑制物),高达30%的未经治疗的严重HA的患者治疗中会产生抑制物，抑制物通过中和输注的FⅧ，降低了治疗的有效性并影响药物动力学，为了清除针对FⅧ的同种抗体，常用免疫耐受诱导策略。然而，这种治疗成本高，需要长期定期输注高剂量FⅧ，且成功率仅为60%～80%[3]。抑制物的产生是替代治疗面临的最大挑战，不仅增加了治疗难度和费用，也增加了患者的致残率和病死率，严重影响患者的生活质量[4-5]。

预测血友病患者产生抑制物的风险的大小，找出影响抑制物产生的因素，有助于及早采取措施预防抑制物的产生，对于高风险的患者可以进行更有效的免疫耐受诱导。

1 抑制物的产生机制

FⅧ抑制物形成的机制尚未完全明了，一般认为抗FⅧ免疫应答主要是CD4+T细胞依赖性体液免疫应答，B细胞活化导致细胞增殖和抗体生产[6-7]。主要是抗原递呈细胞：APC(主要为树突状细胞)、T淋巴细胞和B淋巴细胞共同作用的结果。APC可将抗原肽与Ⅱ类主要组织相容性复合体(MHCⅡ)分子结合形成复合物。外源性FⅧ即抗原肽，FⅧ被APC摄取加工与MHCⅡ类分子结合形成FⅧ-MHCⅡ分子复合物，转运至APC表面，供CD4+T细胞识别。CD4+T细胞与APC表面的MHCⅡ分子结合后被激活并可分泌细胞因子，增殖分化形成效应性T细胞(Th1/Th2细胞)[9]。Th1细胞可分泌γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-2和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)等，主要参与细胞免疫应答，通过募集和活化巨噬细胞引发迟发超敏反应，在宿主抗胞内病原体感染中发挥重要作用；Th2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等细胞因子，主要参与体液免疫应答。抗FⅧ反应主要由Th2细胞介导。B细胞与FⅧ结合后将其摄入并加工处理，以FⅧ-MHCⅡ类分子复合物形式递呈给特异性Th2细胞，并在Th2细胞分泌的IL-4的协助下形成活化的B细胞，活化的B细胞可对Th细胞及APC所分泌的细胞因子产生反应：IL-2、IL-4和IL-5可促进B细胞增殖，经历几轮增殖后在IL-5、IL-6等作用下，B细胞分化为能产生抗体的浆细胞，从而产生FⅧ特异性抗体[10]。

2 影响抑制物产生的因素

2.1 非遗传因素

(1)初次治疗的年龄：初次治疗的年龄越小，FⅧ抑制物产生率越高；(2)FⅧ输注的强度：持续输注FⅧ制剂，抑制物产生率更高；(3)输注FⅧ的种类：重组的FⅧ抑制物产生率高于血浆源性产品；(4)预防治疗的方法及合并感染等[11]。

2.2 遗传因素

(1)种族、家族史；(2)FⅧ基因突变的类型。目前发现HA总共2 107个已知突变，凝血因子突变型是影响抑制物产生的重要因素，在HA中，与具有错义突变或小缺失的患者比较，具有更严重突变(例如内含子22倒位，大缺失和无义突变)的患者中抑制物产生的频率更高，在F8基因突变中，导致完全缺乏蛋白质表达的无效突变患者中抑制物产生的风险最高。

3 抑制物与免疫的关系

遗传因素和非遗传因素的联合作用对抑制物的产生具有重要意义。这些因素可以通过细胞因子激活或抑制免疫应答。细胞因子是由不同细胞对抗原产生的一组可溶性蛋白，它们对天然免疫和适应性免疫反应起调节作用。细胞因子分泌失衡可能影响机体初次接触外源性FⅧ后抑制物的产生，而细胞因子的表达和产生在一定程度上是由基因决定的。与免疫调节相关的细胞因子的基因多态性可影响细胞因子的表达从而影响FⅧ抑制物的生成。

免疫调节因子基因的多态性，包括编码MHC Ⅱ类系统的基因，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，IL-10和细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA4)等被认为是抑制物产生风险的决定因素[12-13]。

4 基因多态性

基因多态性的意思是在一个生物群体中，存在两种及以上不连续的变异型、基因型或等位基因。生物群体中基因多态性的现象十分普遍。人类基因多态性通常分为3大类:DNA片段长度多态性(fragment length polymorphism，FLP)、DNA重复序列多态性(repeat sequence polymorphism，RSP)、单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，SNP)。细胞因子基因调控区的SNP在许多人群中普遍存在，可通过影响细胞因子的转录而影响细胞因子的产生，改变免疫反应的过程[14]。因此，这些细胞因子的基因频率在不同人群中的任何差异都可能具有临床意义，对于获得特异性遗传标记来帮助疾病诊断和预后具有重要意义。

4.1 IL-10

IL-10是一种主要由效应T细胞产生的免疫调节因子,具有很多生物学活性，可作为全身炎症免疫反应的一种抑制因子，同时可以促进活化B淋巴细胞分泌免疫球蛋白。IL-10基因位于染色体lq31、32上，含有5个外显子和4个内含子[15]。其中有的多态性发生在启动子，有的位于非编码区的内含子。IL-10启动子中3个位点的多态性可能改变IL-10基因的表达：1082(G>A)，819(T>C)和592(C>T)位点[16]。这3个位点的基因型与IL-10表达量相关。体外研究表明1082G等位基因的IL-10产量较高，而1082A等位基因的IL-10产量较低。IL-10基因的多态性通过影响IL-10的转录水平，从而影响IL-10的表达量，影响免疫应答的过程。PAVLOVA等[17]的研究中，FⅧ抑制物阳性的血友病患者1082G/G基因的频率较抑制物阴性者明显升高。抑制物阳性的血友病患者GCC核型频率较高，而ACC核型频率较低。国外很多文献[18-19]也得出一致的结论。CHAVES等[20]认为1082、819、592基因的突变是抑制物产生的危险因素。我国王学锋[21]研究了1 435例HA患者，通过IL-10基因的-819C/T、-592A/C多态性检测,得出-819T、-592A患者比-819C、-592C患者更容易产生抑制物的结论。LU等[16]认为819、592基因的突变是抑制物产生的危险因素。

4.2 CTLA4

CTLA4是免疫球蛋白超家族成员，可以编码抑制T淋巴细胞信号转导的蛋白。CTLA4基因位于染色体2q33上，有4个外显子，只表达于活化的T细胞表面，可抑制T细胞依赖性免疫反应[22]。CTLA4与CD28具有同源性,能与CD28竞争性与抗原递呈细胞上的配体B7结合，构成T淋巴细胞活化的第二信号。CD28与B7结合在T细胞激活中起正向调节作用，而CTLA4与B7的结合则起负向调节作用。但CTLA4与B7的亲和力比CD28高至少100倍，可阻断CD28信号[23]。CTLA4基因突变可影响CTLA4与B7亲和力，削弱其对T细胞的抑制作用，导致T细胞异常活化、抗体生成和疾病发生。在FⅧ缺陷小鼠上已证明，用CTLA4抑制抗原递呈细胞上的B7与T淋巴细胞上的CD28之间的相互作用可以防止抑制物的产生。ABDULQADER等[24]研究了CTLA4基因的3种多态性，证明49A>G基因与FⅧ抑制物产生有关。表明CTLA4的多态性可能通过调节这种共刺激分子的水平而对FⅧ的免疫应答产生影响。另有研究表明，启动子-318C/T多态性能影响CTLA4分子的表达[25]。CTLA4的基因多态性(启动子318 C/T和第1外显子49A/G)与该分子在细胞表面不同程度的表达有关[26]。抑制剂的产生与318T等位基因之间存在显著的保护性关联，但与49A/G多态性无关[27]。另一方面，获得性血友病A患者CTLA4 49A/G多态性发生频率高于健康人群[28]。

4.3 TNF-α

TNF-α主要由巨噬细胞和淋巴瘤细胞分泌，在免疫应答调节中起着关键作用。TNF-α基因有4个外显子和3个内含子，位于6号染色体短臂Ⅲ类MHC区域,该区域与某些疾病发生有关[29]。TNF-α基因的SNP多发生在TNF-α基因的启动子区内-308G/A 位点。该位点由-308G/A(GG)、-308G/A(GA)和-308G/A(AA)这3种基因型组成。TNF-α308G/A多态性可能影响TNF-α的表达。-308G/A 位点的A等位基因可增强TNF-α的转录，该位点G/A的突变使TNF-α基因转录及翻译水平失常,导致TNF-α表达异常而诱导过强的免疫应答及炎性反应。虽然FⅧ抑制性抗体的产生是Th2细胞诱导的免疫反应，TNF-α主要与Th1细胞有关。但是，参与抑制物形成的细胞因子是Th1和Th2细胞的共同反应，这进一步说明，TNF-α水平也可能参与调节血友病患者FⅧ的免疫应答。SOORI等[30]研究的结果表明TNF-αrs1800629 G>A多态性降低了甲型血友病患者中抑制物形成的风险；张露璐等[31]研究表明TNF-α-308G/A基因多态性可提示FⅧ抑制物产生的风险。

4.4 HLA-Ⅱ

人类MHC，即编码人类白细胞抗原(HLA)的基因群称为HLA复合体。HLA复合体位于第6号染色体短臂6p21.31，长度约300～4 000 kb，共有239个基因座位。分为Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类。HLA-Ⅱ类基因由DP、DQ、DR 3个亚区组成，其编码的基因及其产物在机体免疫和炎性反应中发挥重要作用[32]。对于细胞外蛋白，如HA患者注射的外源性FⅧ，是HLA-Ⅱ类分子介导抗原肽的加工。HLA是人体多态性最丰富的基因系统。HLA-Ⅱ类分子主要参与抗原的处理与递呈，在将外源性的FⅧ递呈到CD4+阳性的辅助T细胞中起着重要作用。特别是HLA-Ⅱ类等位基因，据报道，DRB 1*15和DQB 1*0602对抑制剂的产生有影响[33]。FⅧ抑制剂阳性的患者中DRB1*15和DQB1*0602基因的频率增高[17,34]。HOSSEINI等[35]研究发现无抑制物产生的血友病患者HLA-DRB1*01:01等位基因显著高于对照组，且认为该等位基因对血友病患者具有保护作用。KIM等[36]在韩国患者中研究发现HLA-Ⅱ类中，DRB1*15与抑制物的产生呈负相关，而C*07:02与抑制物的产生呈正相关。血友病患者产生抑制因子的免疫应答基因大多与HLA-Ⅱ类等位基因有关[37]：HLA-DRB1*14，DRB1*15，HLA-DQB1*06：02，DQB*06：03，HLA-Ⅱ类等位基因。DQA1*01：02和DQA1*01：03和DRB1*15：01/DQB1*06：02单倍型。

5 展 望

免疫调节机制在抑制物产生及血友病预防治疗效果中具有重要的作用。可以通过预测这些因素，有效避免FⅧ抑制物的生成，并提供更有效的治疗。参与免疫调节的因子IL-10、TNF-α、CTLA4、HLA-Ⅱ类分子等均可影响抑制物的生成，而这些因子的产生与基因的多态性密切相关，所以免疫调节因子基因的多态性与FⅧ抑制物产生的风险有关。基因多态性受很多因素的影响，如民族、人种、环境等，我国有多个少数民族分布，民族差异对基因多态性的影响仍需更多的研究，这将有助于针对民族差异为患者提供更有效的诊治。