林一禾 朱淑嫔 陈游沓

浙江省温州市中西医结合医院(325000)

人乳头瘤病毒(HPV)易感染女性宫颈黏膜复层鳞状上皮。多数生育期女性会出现一过性宫颈HPV感染，HPV持续感染是宫颈癌及癌前病变发生发展的独立危险因素[1]，研究发现宫颈癌的发生是多种因素相互作用结果[2]。调节性T淋巴细胞(Treg)是一群发挥免疫抑制功能的独特辅助性T淋巴细胞亚群，可以调控肿瘤免疫应答的整个阶段[3]。本研究分析HR-HPV持续感染患者宫颈Treg的表达，探讨Treg与宫颈高级病变相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2018年5月—2020年10月本院妇科收治的高危型HPV阳性但无需特殊治疗者476例为研究对象。纳入标准：①年龄18～50岁；②行阴道镜下宫颈组织活检，病理学诊断≤低度鳞状上皮内瘤变(LSIL)。排除标准：①妊娠期或哺乳期；②1个月内应用阴道灌洗或阴道用药治疗；③既往进行过宫颈相关治疗；④患有免疫系统疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等；⑤除宫颈癌以外其他器官恶性肿瘤。参照《中国宫颈癌筛查及异常管理相关问题专家共识》中的诊治流程[4]，宫颈活检组织病理学诊断≤LSIL的患者无需治疗但在12个月时需再次行HPV-DNA检测。根据随访结果将研究对象分为HPV持续感染组(178例)与HPV转阴组(298例)。本研究经本院伦理委员会审批。参与对象均签署知情同意书。

1.2 宫颈局部调节性T淋巴细胞检查

一次性阴道窥器充分暴露宫颈，专用刷头于宫颈管顺时针或逆时针旋转3～5圈，将刷头置于液基细胞学保存液中，常规处理后应用流式细胞仪检测单细胞悬液中Treg。将细胞浓度调整至(1～2)×107个/ml，取100μl，加入鼠抗人单克隆抗体，室温避光20min，加冷固定破膜剂，4℃避光孵育30 min，细胞染色，进行流式细胞仪检测，检测CD4+CD25+Foxp3+细胞占CD4+细胞比为Treg百分比。

1.3 HPV-DNA检测

使用一次性阴道窥器充分暴露宫颈，以HPV专用细胞刷于宫颈鳞柱状交界处取材(取材需停留10s)，取材后的细胞刷置于保存液中。HR-HPV由本院检验科医师进行检测，采用杂交捕获2代(HC-Ⅱ)方法，检测13种高危型HPV(HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 Treg表达情况

HPV持续感染组年龄(32.7±10.1岁)与HPV转阴组(33.5±12.9岁)无差异(P>0.05)，Treg(8.2±2.0)%高于HPV转阴组(6.1±3.8)%(t=8.057，P<0.001)。

2.2 HPV持续感染组临床指标与Treg

在HPV持续感染组178例中，年龄≥35岁、多重HPV感染、宫颈活检为LSIL患者Treg值高于年龄<35岁、单一HPV感染、宫颈活检为慢性炎症患者(P<0.05)，体质指数(BMI)≥24kg/m2与<24kg/m2者Treg值未见差异(P>0.05)。见表1。

表1 HPV持续感染组临床指标与Treg比较

2.3 HPV持续感染的高危因素

以HPV持续感染为因变量，以年龄、BMI、HPV感染类型、Treg(以所有研究对象的均值为截断值进行赋值)为自变量行logstic回归分析。结果显示，年龄≥35岁、多重HPV感染、Treg≥7.8%为HPV持续感染的独立高危因素(P<0.05)(表2)。

表2 HPV持续感染的高危因素分析

2.4 Treg对HPV持续感染的预测价值

ROC曲线分析结果显示，Treg对HPV持续感染具有预测效能(P<0.001)，AUC为0.834(95%CI：0.754～0.914)，特异性为69.1%，灵敏度为73.4%，最佳截断值为8.4%。

3 讨论

HPV是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，黏膜型HPV感染是宫颈癌的高危因素。70%～90%免疫正常的女性在感染HPV后12～30个月后可自行清除，仅有小部分患者持续感染而引发宫颈病变[5]。有研究发现宿主的免疫状态和HPV感染引起的免疫逃逸是持续性HPV感染导致宫颈细胞癌变的主要原因[6]。

机体免疫环境复杂多样，HPV、免疫细胞与局部微环境间均存在相互制约、相互调节作用和影响[7]。T淋巴细胞是细胞免疫的主要效应细胞，Treg细胞是T细胞中的一种类型，是CD4+CD25+FOXP3+的T细胞，通过多种机制抑制机体的免疫功能，还可抑制机体对肿瘤的免疫应答，导致肿瘤免疫耐受[8]。有研究[9-10]发现多种感染性或自身免疫性疾病均与Treg细胞引起的免疫逃逸有关。

HPV感染可以导致T细胞活化增殖，Treg细胞的上调抑制机体的免疫应答，使HPV病毒躲过了免疫防护，导致持续感染[11]。有研究发现宫颈癌患者外周血Treg细胞异常升高，且表达量与宫颈癌分期和肿瘤大小有关[12]。目前，多数研究仅分析血液中Treg细胞的异常改变，然而在疾病早期，病变局部免疫抑制出现在机体全身免疫功能改变之前。有研究发现[13]，与HPV病毒载量相比，宫颈局部Treg细胞与宫颈病变的关系更加密切。

本研究发现HPV持续感染者的宫颈Treg细胞表达高于一过性感染者，且持续感染者的Treg细胞表达水平较集中，说明HPV持续感染者宫颈局部免疫抑制明显。比较发现，在HPV持续感染者中年龄≥35岁、多重HPV感染、宫颈活检为LSIL患者Treg高于年龄<35岁、单一HPV感染、宫颈活检为慢性炎症患者，推测年龄、HPV感染种类及宫颈病变与Treg细胞存在相互交叉关系。矫正了年龄、BMI、HPV感染类型后发现，宫颈Treg细胞比例升高是HPV持续感染的独立危险因素，相对于Treg细胞比例<7.8%者来说，≥7.8%者HPV持续感染风险增加2.306倍。此外，宫颈Treg细胞比例对HPV持续感染还具有预测效能，AUC为0.834，预测效能良好，当宫颈Treg细胞>8.4%时预测HPV持续感染的灵敏度为73.4%，特异性为69.1%。

Treg细胞负向调节免疫反应的特性可能导致HPV持续感染，而这种持续感染无疑增加了宫颈癌前病变或宫颈癌的风险。在临床工作中，针对HPV感染的患者应密切关注宫颈局部免疫抑制的微环境，对HPV的转归给予初步预判，有利于个性化治疗随访方案的制定，也有助于HPV阳性患者的管理。