周静月 苏阳2 张小凡 张铭 赵鹏3 邢广群

(青岛大学附属医院，山东 青岛 266555 1 肾内科； 2 心内科； 3 检验科)

矽肺病是由于肺部吸入大量游离的SiO2颗粒所引起，以肺部炎症、肺纤维化和肺功能障碍为特征[1]。进入肺内SiO2颗粒无法排出，引起肺部持续炎症反应，导致免疫平衡紊乱，因此矽肺患者常常伴有肺部肿瘤、肺结核和自身免疫性疾病等并发症[2]。转化生长因子-β1(TGF-β1)是目前最有效的促纤维化细胞因子，主要由肺泡巨噬细胞、肺泡上皮细胞分泌，刺激成纤维细胞增殖和激活，促进肌成纤维细胞形成，是参与肺纤维化发展的关键因子[3]。白细胞介素-6(IL-6)是由活化的T细胞和成纤维细胞产生的多功能细胞因子，可能参与致炎和致纤维化等过程[4]。BRINKMANN等[5]于2004年首次提出，中性粒细胞受病原体激活可释放网状物质来杀灭病原菌，并将这种网状物质命名为中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)。NETs是以DNA为骨架的纤维网状结构，除包裹着髓过氧化物酶(MPO)以及中性粒细胞弹性蛋白酶以外，还含有瓜氨酸化组蛋白H3(CitH3)、组织蛋白酶G、防御素、杀菌/通透性增强性蛋白，其中CitH3是NETs的标志物。MPO是含血红素辅基的过氧化物酶，存在于髓系细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)的嗜苯胺蓝颗粒中，是髓系细胞发挥固有免疫功能的重要标志物[6]。研究显示MPO参与了矽肺肺组织的炎症反应，过量的MPO产生的氧化剂可诱导肺组织发生氧化性损伤[7]。本研究拟采用气管内注入SiO2颗粒的方法建立矽肺纤维化实验模型，探讨CitH3、MPO、IL-6和TGF-β1在矽肺发生中的作用及其机制，以期为矽肺患者的治疗提供新的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雄性Wistar-Kyoto大鼠30只，6～8周龄，体质量(200±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，随机分为矽肺组和对照组，每组15只大鼠，饲养于青岛大学附属医院动物实验中心。大鼠的处理规程获得青岛大学动物保护和使用委员会认证，动物护理和实验操作程序符合美国国立卫生研究院制定的《实验动物管理与使用指南》伦理标准及动物伦理委员会指导方针。

1.2 主要试剂

SiO2颗粒(S817558，上海麦恪林生化科技有限公司)，CitH3抗体(Ab219406，英国Abcam公司)，MPO单克隆小鼠抗体(Ab90810，英国Abcam公司)，Alex Fluor®488标记山羊抗兔抗体(GB25303，武汉赛维尔生物科技有限公司)，Cy3标记山羊抗小鼠IgG(GB210301，武汉赛维尔生物科技有限公司)；EDTA(pH 8.0)抗原修复液、大鼠TGF-β1 ELISA试剂盒、DAPI染液、IL-6 ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)；将SiO2颗粒和生理盐水混合配置成浓度为50 g/L的SiO2混悬液，经高压灭菌后加入青霉素2 000 U备用。

1.3 方法

1.3.1大鼠矽肺模型的建立及两组的处理 参照程燚等[8]的方法制备大鼠矽肺模型。大鼠麻醉固定后，消毒颈部皮肤，沿颈部正中线切开5～7 mm，暴露气管。矽肺组大鼠气管内一次性注入预配好的SiO2混悬液1 mL，对照组大鼠气管内一次性注入等体积的高压蒸汽灭菌的生理盐水1 mL，缝合伤口，待大鼠苏醒后置于动物房常规饲养。两组大鼠均于第28天时麻醉后采集腹主动脉血，以3 000 r/min离心10 min收集血清；然后处死大鼠剥离出肺脏，用生理盐水清洗以后，观察肺脏形态同时称肺脏湿质量，计算肺脏器系数，肺脏器系数=肺组织湿质量(mg)/体质量(g)。

1.3.2肺组织病理组织学观察 将大鼠的肺组织以40 g/L的多聚甲醛固定，石蜡包埋后，制作5 μm厚切片，行HE染色，由青岛大学附属医院高年资病理医师于光学显微镜下观察大鼠肺组织病理情况。

1.3.3ELISA法检测大鼠血清中TGF-β1、IL-6以及CitH3水平 采用ELISA试剂盒按照双抗夹心法检测大鼠血清中TGF-β1、IL-6以及CitH3的水平，并于酶标仪上在波长450 nm处测量各孔的吸光度值，根据标准品的浓度以及对应的吸光度值计算出TGF-β1、IL-6及CitH3的水平。

1.3.4免疫荧光染色法检测大鼠肺组织中CitH3和MPO的表达 肺组织切片脱蜡至水后，置于抗原修复缓冲液中，微波炉内行抗原修复，自然冷却后置于PBS中，然后于脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。稍甩干后置于湿盒中，加入自发荧光淬灭剂中5 min，流水冲洗10 min，再滴加山羊血清封闭组织中非特异性抗原60 min。然后轻轻甩掉封闭液，在切片上滴入稀释好的CitH3(1∶50)以及MPO(1∶50)，切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜。然后将切片置于PBS中，然后在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。稍甩干后滴加Alex Fluor®488标记山羊抗兔抗体(1∶400)以及Cy3标记的山羊抗小鼠IgG(1∶300)覆盖组织，避光室温孵育50 min，染色完成以后在摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。待切片稍干后，滴加DAPI染液，避光孵育10 min。切片于PBS中洗涤3次，每次5 min。干燥后，用抗荧光淬灭封片剂封片。置于荧光显微镜下观察切片并采集图像。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 两组大鼠肺脏器系数比较

饲养期间两组大鼠均无意外死亡。大体观察可见，对照组大鼠肺组织呈粉红色，柔软有弹性；矽肺组大鼠肺组织表面呈灰白色，质地坚硬且弹性差，切面有磨砂感。对照组和矽肺组大鼠肺组织湿质量分别为(3.07±0.64)、(4.01±0.40)g，肺脏器系数分别为3.88±1.44、6.37±2.81，与对照组相比，矽肺组肺组织湿质量以及肺脏器系数均显著高于对照组(t=-4.10、-3.06,P<0.05)。

2.2 两组大鼠肺组织病理学检查结果比较

HE染色切片显示，对照组大鼠肺组织结构清晰，无炎性细胞浸润(图1A)；矽肺组大鼠肺组织可见各种炎症细胞浸润和增生，肺泡间隔增厚，正常肺泡结构明显减少(图1B)。

A：对照组大鼠肺组织，B：矽肺组大鼠肺组织，HE染色，200倍

2.3 两组大鼠血清中TGF-β1、IL-6及CitH3表达水平比较

矽肺组大鼠血清中CitH3、TGF-β1及IL-6水平与对照组比较明显升高(t=-29.85～-3.22，P<0.05)。见表1。

表1 两组大鼠血清中CitH3、IL-6和TGF-β1表达水平比较

2.4 两组大鼠肺组织中CitH3和MPO比较

荧光显微镜下观察显示，矽肺组肺组织中红色荧光免疫反应阳性产物MPO和绿色荧光免疫反应阳性产物CitH3较对照组明显增加(图2)。

3 讨 论

矽肺通常是由于长期吸入大量游离性的SiO2颗粒所引起，以肺部广泛的结节性纤维化为主要特征。目前，矽肺的发病机制尚未明确，因此探讨其发病机制及寻找有效的治疗药物非常重要。RADA[9]研究发现，SiO2颗粒可刺激外周血中性粒细胞产生大量的NETs，且与SiO2颗粒的浓度具有剂量相关性，提示NETs在SiO2颗粒所致矽肺发生中发挥着重要作用。当机体长期暴露于SiO2颗粒环境中时，SiO2颗粒易经气道沉积于肺组织中，激活肺泡巨噬细胞的吞噬功能，产生大量的炎症因子与氧化应激产物[10-11]。大量因子的持续增加进一步导致神经细胞和成纤维细胞的持续招募，继而产生过量的胶原和纤维连接蛋白，促进肺组织纤维化[12]。矽肺患者与矽肺动物模型肺泡灌洗液中均发现有大量的中性粒细胞，当降低肺泡灌洗液中的中性粒细胞水平后，矽肺损伤程度随之减轻，提示NETs可能参与了SiO2颗粒诱导的小鼠矽肺模型肺部炎症损伤与纤维

CitH3染色呈绿色，MPO染色呈红色，DAPI染色呈蓝色，免疫荧光染色，200倍

化的过程[13-14]。

中性粒细胞在受到细胞因子、病原微生物或一些化合物的刺激时，会形成以染色质DNA为骨架、包裹着颗粒蛋白(如MPO和中性粒细胞弹性蛋白酶)的NETs网状结构，这种网状结构具有抵抗病原菌入侵的作用，但NETs过度产生时可致组织细胞损伤和强烈的炎症反应[15]。本研究以气管内注入SiO2混悬液的方法建立大鼠矽肺模型，免疫荧光染色法检测显示，大鼠肺组织中CitH3和MPO表达水平均显著升高，说明CitH3和MPO可能参与了大鼠矽肺纤维化的过程。本研究结果显示，矽肺组大鼠的部分肺组织发生实变，HE染色切片显示肺组织内有淋巴细胞和巨噬细胞浸润，肺泡腔内充满炎性渗出物，出现明显的肺纤维化，与先前的研究结果一致[16]。同时ELISA方法检测显示矽肺组大鼠血清中CitH3、TGF-β1及IL-6水平较对照组明显升高。IL-6是一种多效应的细胞因子，主要由巨噬细胞和T细胞分泌，参与机体的炎症反应、免疫应答、创口修复[17]。同时IL-6还具有促进胶原蛋白聚集和肺成纤维细胞增殖的作用[18]。TGF-β1是组织纤维化的重要调节因子，主要通过激活其下游的Smad信号通路，引发促纤维化基因过表达，致瘢痕组织形成。已研究证实，TGF-β1/Smad通路失调是组织纤维化的重要致病机制[19]。有研究发现矽肺病患者支气管肺泡灌洗液中NETs含量越高，患者病情越重，肺功能损害越重[20]。研究发现NETs促进纤维化发生的机制可能与促进纤维母细胞分化以及加速细胞外基质合成有关[21]。以上研究均表明CitH3、MPO、TGF-β1及IL-6可能参与大鼠肺组织纤维化的过程。

综上所述，SiO2颗粒可能通过激活中性粒细胞释放CitH3和MPO以及促进TGF-β1、IL-6等相关因子的表达来加重矽肺大鼠肺组织炎症与纤维化的发生。CitH3和MPO、TGF-β1和IL-6水平的升高可能是致肺组织炎症和纤维化的重要因素。