李圣琦 杨 峥 吴林秀

(1 广西卫生职业技术学院医学系，南宁市 530023，电子邮箱：22535821@qq.com；2 广西医科大学第一附属医院检验科，南宁市 530021)

随着人们生活水平的提高，饮食丰盛和运动缺乏使得2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)已经逐渐成为影响国民健康的主要因素，仅次于心脑血管疾病与恶性肿瘤[1-2]。有数据显示，中国T2DM的患病率约11%，60岁以上的老年人糖尿病患病率在20%以上[3]。糖尿病能够引发一系列严重并发症，进一步影响人们的生活质量。目前虽有很多关于T2DM遗传方面的发病机制的研究报道，但仍需进一步探讨。

近年来，随着微阵列技术的广泛应用，越来越多研究者利用高通量的表达谱分析平台检测各种疾病中基因的表达差异，来分析疾病发展过程中遗传变异的情况[4]。尽管在过去的几十年，对T2DM的机制研究越来越清晰，并且已经有相关研究利用表达谱技术分析相关基因在T2DM中的作用[5]，但是关于差异基因和微小RNA(microRNA,miRNA)通过何种分子途径相互作用，却鲜有研究报道。因此，我们利用生物信息学方法分析T2DM中差异表达的信使RNA(message RNA,mRNA)和miRNA之间的相互作用，特别是相互作用网络中的路径，以总结关键mRNA和miRNA在T2DM中的潜在作用机制。

1 资料与方法

1.1 mRNA和miRNA基因芯片表达谱数据的收集 通过公开的GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)检索与T2DM相关的研究，获得两个基因表达谱数据集(GSE76895和GSE27645)进行分析。每个数据集均含有T2DM组织样品和正常组织样品，其中GSE76895包含36例T2DM患者、32例正常人以及15例糖耐量受损患者的胰岛组织芯片数据，GSE27645包含14例T2DM患者以及10例正常人外周血miRNA谱芯片数据。

1.2 差异表达mRNA和差异表达miRNA的筛选 利用交互式在线分析工具GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)分析并筛选T2DM和正常组织样品之间差异表达的mRNA和miRNA[6]。为了防止假阳性结果的发生，在GEO2R分析中。差异基因设置标准为校正后P值<0.05和|logFC|≥1。

1.3 差异表达mRNA的功能和途径富集分析 利用在线工具DAVID[7](https://david.ncifcrf.gov/)和PANTHER[8](http://www.pantherdb.org/)分别对差异表达的mRNA进行基因本体论(Gene Ontology,GO)和通路富集分析。以P值<0.05为标准。

1.4 蛋白质相互作用网络的构建 利用STRING(http://string-db.org/)在线分析软件，将差异表达的mRNA进行映射获得蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络[9]，然后使用Cytoscape进行可视化[10]。

1.5 miRNA靶标的预测、mRNA-miRNA网络的构建与模块分析 利用在线工具miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)预测来自GSE27645的差异表达miRNA的靶基因[11]。将差异表达miRNA的靶基因与差异表达mRNA进行比对以获得用于进一步分析的交集，获得miRNA-mRNA相关对列，采用Cytoscape绘制miRNA-mRNA网络图。最后通过FunRich软件[12]预测与差异表达miRNA相互作用的转录因子。

2 结 果

2.1 差异表达mRNA和差异表达miRNA的筛选结果 数据集GSE76895中，与正常人相比，T2DM患者有40个差异表达mRNA，其中表达上调的mRNA共23个，表达下调的mRNA共17个，见图1A及表1；其中与免疫相关的mRNA包括SCTR、TSHR、ARG2、FAM19A4、CALCA、SPP1，见表2。数据集GSE27645中，与正常人相比，T2DM患者有67个差异表达miRNA，其中表达下调的miRNA共66个，表达上调的miRNA共1个，见图1B及表1。

图1 差异表达mRNA和miRNA火山图

表1 数据集GSE76895与GSE27645的差异基因

表2 与免疫相关的差异表达mRNA

2.2 差异表达mRNA的功能和通路富集分析 GO富集分析表明，差异表达mRNA的蛋白产物在生物过程相关类别中与成人运动行为、pH调节相关，蛋白产物部分位于细胞膜、细胞外酶，分子功能主要涉及蛋白质二聚活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，见表3。通路分析结果显示，差异表达mRNA共富集于12个通路，包括胆囊收缩素受体(cholecystokinin receptor,CCKR)信号通路、钙黏着蛋白信号通路、果糖半乳糖代谢信号通路、γ-氨基丁酸合成信号通路、糖酵解信号通路、亨廷顿病相关信号通路、离子型谷氨酸受体途径、Ⅰ组代谢型谷氨酸受体信号通路、Ⅲ组代谢型谷氨酸受体信号通路、毒蕈碱型乙酰胆碱受体1和3信号通路、Toll 受体信号通路、Wnt信号通路。

表3 差异表达mRNA的GO分析结果

2.3 PPI网络 利用已识别的差异表达mRNA绘制了43个节点(3个为新增预测的其他相关蛋白)和33个边缘的PPI网络，平均节点度为1.44，平均局部聚类系数为1.6e-05。利用MCODE插件筛选出K值较高的前3个节点作为网络中关键核心基因，分别为SCTR、TSHR、CALCA。 见图 2。

图2 差异表达基因蛋白PPI网络及核心基因注：图A为差异表达mRNA的PPI网络； 图B为PPI网络中展示的核心基因，其中红色为上调的基因，绿色为下调的基因。

2.4 miRNA-mRNA网络以及与miRNA相互作用的潜在转录因子 针对GSE27645数据集获得的差异表达miRNA，使用miRDB数据库预测共获得19 414个靶基因。通过将差异表达miRNA的靶基因与差异表达mRNA进行比较，取交集后得到37个miRNA-mRNA负相关对列，利用Cytoscape绘制miRNA-mRNA网络图(图3A)。其中，miRNA-16-5p是表达下调最明显的miRNA之一，其靶向丙酮酸脱氢酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4)；同时，PDK4可能被3种miRNA靶向调控，包括miRNA-103a-3p、miRNA-107、miRNA-15b-5p。通过FunRich软件预测与差异表达miRNA相互作用的转录因子，发现转录因子SP1、早期生长应答因子(early growth response 1,EGR1)是最显著的潜在靶标，见图3B。

图3 差异表达mRNA的通路分析结果

图3 miRNA-mRNA网络图及miRNA相关转录因子注：图A为miRNA-mRNA网络图，其中圆圈表示mRNA，三角形表示miRNA，红色表示上调，绿色表示下调； 图B为miRNA相关转录因子。

3 讨 论

T2DM是影响国民健康水平的主要疾病，尽管针对糖尿病的研究受到了广泛的关注，但涉及驱动T2DM发生和发展的重要基因和途径有待进一步研究，对T2DM的早期诊断和基因治疗仍是目前亟待解决的问题。微阵列技术的成熟应用使得确定疾病中的遗传改变变得更加简便，从而可以用于相关疾病的靶标基因筛选。因此，本文利用微阵列获得的表达谱数据对T2DM发生的因素和机制进行深入研究。

在本研究中，共筛选出40个差异表达的mRNA，包括23个表达上调基因和17个表达下调基因；GO富集分析表明，这些差异表达mRNA的蛋白产物在生物过程相关类别中与成人运动行为、pH调节等相关，主要涉及的通路有CCKR信号通路、钙黏着蛋白信号通路、果糖半乳糖代谢、γ-氨基丁酸合成、糖酵解等。其中与免疫相关的mRNA包括SCTR、TSHR、ARG2、FAM19A4、CALCA、SPP1。通过构建PPI网络，我们鉴定出3个核心基因，包括表达下调的SCTR，以及表达上调的TSHR、CALCA。(1)SCTR是胰高血糖素受体家族的成员。SCTR蛋白定位在胰管和胆管内的上皮细胞上，其与特异性促胰液素结合，参与不同的生物过程[13]。近期，有学者提出一种新观点，即SCTR在饮食诱导的热生成中也起着核心作用：充当介导餐前热生成的非交感性棕色脂肪活化剂，从而引起饱食感；饭后肠道释放的促胰液素与棕色脂肪细胞中的SCTR结合，通过刺激脂解作用来激活棕色脂肪的生热作用，这种作用在大脑中被感知并促进饱食感[14]。由此推测，SCTR可能影响消化生物过程和脂肪分解代谢途径，SCTR的下调导致饭后饱食感下降，在T2DM的发生中发挥作用。(2) TSHR 是一种蛋白质编码基因，与甲状腺功能减退、甲状腺功能亢进、家族性妊娠疾病等疾病相关。TSHR是由α和β两个亚基组成的蛋白质，它们的激活导致细胞内腺苷酸环化酶水平的增加。TSHR属于G蛋白偶联受体，与酪氨酸激酶受体之间存在交互作用，有研究表明TSHR与胰岛素受体通路之间存在枢纽—胰岛素受体底物1，且具有胰岛素抵抗的患者表达异常磷酸化的胰岛素受体底物1，这阻碍了胰岛素受体依赖性信号传导级联反应[15]。由此推测，TSHR的上调导致胰岛素受体底物1异常磷酸化，导致胰岛素抵抗发生，从而在T2DM的发生中发挥作用。(3)CALCA是一种蛋白质编码基因，与CALCA相关的疾病包括反射性交感神经营养不良和椎管狭窄。目前关于CALCA与T2DM的相关性研究较少。有研究表明，T2DM小鼠模型中CALCA启动子目标片段中的DNA甲基化水平上调，从而降低从T2DM小鼠模型中提取而来的脂肪来源干细胞中CALCA的表达[16]。这一研究结果与本研究结果不符，有待进一步行基因检测证实CALCA与T2DM发生的相关性。

miRNA是非编码RNA，其主要通过miRNA的5′UTR与RNA靶序列的3′UTR结合，从而导致RNA靶序列降解或翻译抑制[17]。研究表明，miRNA的失调是多种疾病发病机理的重要组成部分[18]。本研究在T2DM中鉴定出67个差异miRNA，包括66个下调的miRNA和1个上调的miRNA。miRNA-mRNA网络分析结果显示，miRNA-16-5p是下调最明显的miRNA之一，其靶向调控丙酮酸脱氢酶。丙酮酸脱氢酶是丙酮酸脱氢酶/支链酮酸脱氢酶激酶蛋白激酶家族的成员，是具有组氨酸激酶结构域的线粒体蛋白。该蛋白位于线粒体的基质中，PDK4通过丙酮酸脱氢酶亚基A1和A2的磷酸化，抑制丙酮酸脱氢酶复合物形成，从而在葡萄糖、脂肪酸代谢和体内稳态的调节中起关键作用[19]。研究表明，PDK4参与胰岛素信号的级联反应，通过对丙酮酸脱氢酶活性的调节，在维持正常的血糖水平、血液pH值和酮体，以及调节脂肪酸氧化和生物合成中起重要作用[20]。此外，还有研究显示，肥胖和T2DM患者肌肉组织中的PDK4 mRNA表达增加，从而影响胰岛素生成[21]。2008年，Rasche等[22]对人类和小鼠中多个组织的213个T2DM基因集进行了荟萃分析，同样发现PDK4参与了T2DM的发生。以上发现与我们预测的结果相一致。

此外，miRNA-mRNA网络分析结果显示，miRNA-103a-3p、miRNA-107与miRNA-15b-5p可能起到协同靶向PDK4的作用。最近有学者在关于肥胖患者手术前后miRNA的差异研究中，同样鉴定出了miRNA-16-5p作为调控网络中的重要一员[23]。Tang等[24]首先将miRNA-107与糖尿病和葡萄糖代谢联系起来，提出miRNA-107的失调可以导致炎症、肥胖与胰岛素抵抗的发生。另外，一项针对miRNA与T2DM的研究也表明，miRNA-107在肥胖症和T2DM患者中表达明显失调[25]。由此可见，miRNA-16-5p、miRNA-103a-3p、miRNA-107与miRNA-15b-5p等miRNA可能在T2DM的病理生理过程中起到关键作用。

总之，通过全面的生物信息学分析，共筛选出了与T2DM有关的40个差异表达mRNA和67个差异表达miRNA，其中核心基因SCTR、TSHR、CALCA，以及miRNA-16-5p、miRNA-103a-3p、miRNA-107与PDK4的调控网络，可能为T2DM的诊断和治疗提供新的线索。