董建国 ， 陈明睿 ， 饶 丹 ， 何书海 ， 焦凤超 ， 张广强 ， 邓凯伟 ， 黄 立 ， 赵攀登

(1. 信阳农林学院牧医工程学院 ， 河南 信阳 464000 ； 2. 河南牧业经济学院动物医学院 ， 河南 郑州 450046)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)于1971年在英国首次暴发，随后传播到世界许多国家，呈地方流行性[1-4]。2010年以后，我国许多养殖场发生严重腹泻，感染率高达100%，发病仔猪死亡率高达80%～100%，给我国养猪业造成严重的经济损失。研究显示，目前猪只的腹泻主要是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株引起[5-6]。

干扰素诱导内质网关联病毒抑制蛋白(Virus inhibitory protein,endoplasmic reticulum associated,interferon inducible，Viperin)是干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)表达的蛋白之一[7]。该蛋白属于内质网相关蛋白，全长由361个氨基酸组成，包括3个关键的功能区。第1个功能区是N端，有助于细胞中Viperin蛋白的定位。第2个功能区位于Viperin中间区域，称为SAM 结构域[7]。第3个功能区是Viperin的 C-末端，该区域高度保守，具有抗病毒功能[8]。本试验通过扩增猪Viperin基因，构建Viperin各功能区质粒，转染Vero E6细胞研究Viperin各功能区对PEDV RNA合成的影响，为进一步研究宿主细胞中Viperin调控PEDV感染机制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 Vero E6细胞和PEDV GDgh 毒株由国家猪业工程技术中心猪病研究室(后文简称本实验室)保存[9]；质粒pWPXL，购自Addgene公司；Lipofectamine®LTX，购自 Invitrogen 公司；化学发光检测试剂盒(RPN2135)，购自GE Healthcare 公司；细胞裂解液(RIPA)(P0013)、PMSF(ST506)和 DAPI(C1005)，均购自碧云天公司；PrimeSTARTMHS DNA Ploymerase PCR 扩增酶，购自宝生物工程(大连)有限公司；Wizard®Plus Midipreps DNA Purification System和蛋白酶K，均购自Promega公司；T4 DNA 连接酶、SupperMixTaqDNA聚合酶、dNTPs、DL2 000 Plus和DNA琼脂糖胶回收试剂盒，均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 引物的设计与合成 参考GenBank 中已经发布的Viperin基因(登录号：NM_213817.1)序列……