董建国 ， 陈明睿 ， 饶 丹 ， 何书海 ， 焦凤超 ， 张广强 ， 邓凯伟 ， 黄 立 ， 赵攀登

(1. 信阳农林学院牧医工程学院 ， 河南 信阳 464000 ； 2. 河南牧业经济学院动物医学院 ， 河南 郑州 450046)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)于1971年在英国首次暴发，随后传播到世界许多国家，呈地方流行性[1-4]。2010年以后，我国许多养殖场发生严重腹泻，感染率高达100%，发病仔猪死亡率高达80%～100%，给我国养猪业造成严重的经济损失。研究显示，目前猪只的腹泻主要是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株引起[5-6]。

干扰素诱导内质网关联病毒抑制蛋白(Virus inhibitory protein,endoplasmic reticulum associated,interferon inducible，Viperin)是干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)表达的蛋白之一[7]。该蛋白属于内质网相关蛋白，全长由361个氨基酸组成，包括3个关键的功能区。第1个功能区是N端，有助于细胞中Viperin蛋白的定位。第2个功能区位于Viperin中间区域，称为SAM 结构域[7]。第3个功能区是Viperin的 C-末端，该区域高度保守，具有抗病毒功能[8]。本试验通过扩增猪Viperin基因，构建Viperin各功能区质粒，转染Vero E6细胞研究Viperin各功能区对PEDV RNA合成的影响，为进一步研究宿主细胞中Viperin调控PEDV感染机制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 Vero E6细胞和PEDV GDgh 毒株由国家猪业工程技术中心猪病研究室(后文简称本实验室)保存[9]；质粒pWPXL，购自Addgene公司；Lipofectamine®LTX，购自 Invitrogen 公司；化学发光检测试剂盒(RPN2135)，购自GE Healthcare 公司；细胞裂解液(RIPA)(P0013)、PMSF(ST506)和 DAPI(C1005)，均购自碧云天公司；PrimeSTARTMHS DNA Ploymerase PCR 扩增酶，购自宝生物工程(大连)有限公司；Wizard®Plus Midipreps DNA Purification System和蛋白酶K，均购自Promega公司；T4 DNA 连接酶、SupperMixTaqDNA聚合酶、dNTPs、DL2 000 Plus和DNA琼脂糖胶回收试剂盒，均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 引物的设计与合成 参考GenBank 中已经发布的Viperin基因(登录号：NM_213817.1)序列信息，设计合成扩增猪Viperin基因各功能区的引物序列，进行PCR扩增及片段回收，最后将扩增片段连接到pWPXL载体上，载体上有GFP标签，位于多克隆位点后面，与插入基因融合表达，引物序列V△CF：AGCTTTGTTTAAACACCATGTGGACACTGGTAC，V△CR：CGCGCGACGCGTAAGGCCACTTTATAATCCCT，用于扩增Viperin△C结构域；V△NF:AGCTTTGTTTAAACACCATGGGGGGTGATAGGAGCC，V△NR:CGCGCGACGCGTAACCAGTCCAGCTTCAGGTC，用于扩增Viperin△N结构域；V△SAMF:AGCTTTGTTTAAACACCATGTGGACACTGGTAC，V△SAMR:CGCGCGACGCGTAACCAGTCCAGCTTCAGGTC，用于扩增Viperin△SAM结构域。以上引物均由苏州金维智科技有限公司合成。

1.3 重组表达质粒的构建 用以上引物以实验室保存的pWPXL-Viperin质粒为模板，扩增Viperin各功能域，并进行胶回收，用限制性内切酶PmeI和MluI将回收的各个功能域片段在37 ℃下酶切4 h，随后将酶切产物回收纯化，回收的片段与pWPXL质粒进行连接，连接产物转化TOP10感受态细胞，于37 ℃下摇菌45 min，接着3 000 r/min离心2 min，弃掉上清，将菌液涂于含氨苄霉素的 LB 平板上，随后将平板放置于37 ℃培养箱进行过夜培养。将鉴定阳性的菌落扩增，提取质粒，分别命名为 pWPXL-Viperin△N、pWPXL-Viperin△SAM、pWPXL-Viperin△C，并送苏州金维智科技有限公司进行测序。

1.4 重组蛋白质的免疫荧光和蛋白印迹鉴定 6孔板培养Vero细胞，待细胞密度达到70%～80%时，将重组质粒pWPXL、pWPXL-Viperin△N、pWPXL-Viperin△SAM、pWPXL-Viperin△C(重组质粒带有GFP标签)转染Vero E6细胞。每个质粒各做1个重复，1份用无水乙醇固定，荧光显微镜观察蛋白表达情况；另1份转染36 h后将Vero E6细胞收集，裂解后加入 Loading buffer，煮沸10 min，离心取上清进行 SDS-PAGE试验和Western Blot试验，PVDF膜于脱脂乳中室温封闭 2 h，随后加入GFP-Tag mAb室温孵育2 h，洗涤3次，加入羊抗小鼠IgG-HRP，室温轻摇0.5 h，洗涤3次，将显色液均匀滴加到PVDF膜上，用FluorChem E型凝胶成像仪显色。

1.5 Viperin对PEDV增殖的影响 Vero E6细胞转染pWPXL、pWPXL-Viperin质粒，转染后12 h接种PEDV(MOI=0.1)，分别于感染后36 h和48 h收取细胞和上清，-20 ℃反复冻融3次，离心去除沉淀，收集上清，提取培养液中的核酸，荧光定量PCR检测PEDV拷贝数，确定Viperin基因过表达对PEDV增殖的影响，荧光定量PCR为TaqMan探针法，引物基于PEDVN基因进行设计，上游引物F：AACAACCTTCCAATTGGCATT；下游引物R：AACCCAGAAAACACCCTCAGT；探针：CTACTACCTYGGAACAGGACCTCACGG。

1.6 siRNA干扰Viperin基因对PEDV增殖的影响 针对猴Viperin基因(登录号：XM_005576618)序列设计3对siRNA分别干扰Vero E6细胞中的Viperin基因(表1)，干扰后24 h收集细胞检测干扰效果；同时，对干扰的Vero E6细胞接种PEDV(MOI=0.1)，分别于感染后36 h和48 h收取细胞和上清，-20 ℃反复冻融3次，提取培养液中的核酸，荧光定量PCR检测PEDV拷贝数，确定siRNA干扰Viperin基因对PEDV增殖的影响。

表1 干扰Viperin基因的siRNA序列信息Table 1 siRNA sequence for interfering Viperin gene

1.7 Viperin各功能区对PEDV增殖的影响 Vero E6细胞转染pWPXL、pWPXL-Viperin△N、pWPXL-Viperin△SAM、pWPXL-Viperin△C质粒，转染后12 h接种PEDV(MOI=0.1)，分别于感染后36 h和48 h收取细胞和上清，-20 ℃反复冻融3次，提取培养液中的核酸，荧光定量PCR检测PEDV拷贝数，确定Viperin各功能域对PEDV增殖的影响。

2 结果

2.1 重组质粒的构建与鉴定 Viperin共包括3个功能区，C末端区域、N末端区域和Sam区域，Viperin△C是缺失C末端区域，Viperin△N是缺失N末端区域，Viperin△Sam是缺失Sam区域，各功能区如图1所示。用1.2中引物进行片段扩增，随后回收片段并用PmeI和MluI进行双酶切，连接后转化 TOP10感受态细胞，培养12～16 h，挑取阳性菌落扩增，提取质粒进行双酶切鉴定，结果表明Viperin基因成功克隆至 pWPXL 中(图2)，将重组质粒命名为 pWPXL-Vip。随后进行测序，证实Viperin基因正确插入质粒中。

图1 Viperin各截短蛋白示意图Fig.1 Schematic diagram of each truncated Viperin protein

图2 Viperin各截短片段质粒酶切鉴定图Fig.2 Enzyme digestion identification map of each fragment plasmid of Viperin1：DNA Marker 10 000 bp; 2：pWPXL-Viperin△N; 3：pWPXL-Viperin△N双酶切; 4：pWPXL-Viperin△C; 5：pWPXL-Viperin△C双酶切; 6：pWPXL-Viperin△SAM; 7：pWPXL-Viperin△SAM双酶切1:DNA Marker 10 000 bp; 2:pWPXL-Viperin△N; 3:Double enzyme digestion of pWPXL-Viperin△N; 4:bpWPXL-Viperin△C; 5:Double enzyme digestion of pWPXL-Viperin△C; 6:pWPXL-Viperin△SAM; 7:Double enzyme digestion of pWPXL-Viperin△SAM

2.2 重组蛋白的免疫荧光鉴定 将构建成功的重组质粒分别转染Vero E6细胞，于转染后24 h 进行免疫荧光试验，如图3所示，各个转染细胞均有特异性荧光，完整蛋白Viperin、截短蛋白Viperin△C和Viperin△Sam在细胞质中表达，Viperin△N在细胞质和细胞核中均有表达。

图3 重组蛋白的荧光鉴定Fig.3 Fluorescence identification of recombinant protein

2.3 重组蛋白的Western Blot鉴定 运用Western Blot试验检测Vero E6细胞中各个截短蛋白的表达情况，结果显示完整蛋白Viperin、截短蛋白Viperin△N、Viperin△C和Viperin△Sam有特异性条带，表明在细胞中正确表达(图4)。

图4 Western Blot检测Viperin各截短蛋白在Vero细胞中的表达Fig.4 Western Blot analysis of each truncatedViperin protein in Vero cells

2.4 过表达Viperin对PEDV增殖的影响 为了确定Viperin对PEDV增殖的影响，pWPXL、pWPXL-Viperin△N、pWPXL-Viperin△SAM、pWPXL-Viperin△C质粒转染Vero E6细胞，于转染后24 h用PEDV (MOI=0.1)接种细胞，分别于接种后36 h和48 h收集上清和细胞，反复冻融3次，提取核酸，荧光定量RT-PCR检测PEDV在细胞中的病毒拷贝数，结果显示PEDV感染后36 h和48 h 拷贝数显著高于对照组(图5)，说明Viperin能够促进PEDV RNA合成。

图5 过表达Viperin促进PEDV增殖Fig.5 Overexpression of Viperin promotes PEDV replication*：P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.005;下同*：P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.005. The same as below

2.5 干扰Viperin基因表达抑制PEDV增殖 设计3对siRNA，转染Vero E6细胞，分别于转染后24 h收集细胞，提取核酸，荧光定量RT-PCR检测细胞中Viperin的转录水平，结果显示设计的3对siRNA均能干扰Viperin的表达(图6A)。选取siViperin-2干扰Vero细胞中Viperin，随后接毒进行PEDV拷贝数检测，结果显示：与对照组相比，干扰细胞中Viperin能显著抑制PEDV RNA的合成(图6B)。

图6 干扰Viperin基因表达抑制PEDV增殖Fig.6 Interfering Viperin gene expression inhibits PEDV proliferationA：siRNA干扰Viperin转录效果检测； B：siRNA干扰Viperin对PEDV增殖的影响A:Detection of Viperin transcriptional effect of siRNA interference; B:Effects of siRNA interference with Viperin on PEDV proliferation

2.6 Viperin各功能区过表达对PEDV增殖的影响 将重组质粒pWPXL-Viperin△C、pWPXL-Viperin△N、pWPXL-Viperin△SAM分别转染Vero E6细胞，24 h后接种PEDV，接毒后24 h收取细胞和上清，提取核酸，荧光定量检测PEDV拷贝数，结果如图7所示，与对照相比，Viperin的C末端区域能够显著促进PEDV RNA的合成。

图7 Viperin各功能区对PEDV增殖的影响Fig.7 Effects of Viperin functional regoins on PEDV proliferation

3 讨论

干扰素(Interferon,IFN)是机体先天性免疫中重要的抗病毒因子，能够诱导不同的ISGs表达发挥不同的抗病毒作用。Viperin作为ISGs，一方面可以抑制病毒的复制，发挥抗病毒作用。研究显示：猪Viperin与猪瘟病毒E2和5A蛋白相互作用，抑制病毒增殖[10-11]；猪Viperin还可以抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒入侵和基因组的复制和转录[12]；羊Viperin能够与山羊副流感病毒3型病毒N蛋白相互作用，抑制病毒增殖[13]；鸡Viperin可能通过与新城疫病毒Matrix蛋白相互作用抑制病毒增殖[14]。Viperin抑制病毒复制机制是多样的，A型流感病毒感染过程中，Viperin破坏脂筏的形成进而抑制病毒复制[15]。马传染性贫血病毒感染过程中，Viperin可以阻止病毒Gag蛋白的出芽，进而抑制病毒增殖，同时Viperin还可以破坏宿主细胞内质网结构，阻断病毒囊膜的合成，同时Viperin还可以通过阻止马传染性贫血病毒受体蛋白ELR-1的表达，进而抑制马传染性贫血病毒侵入细胞[16]。

另一方面，Viperin又能促进病毒的增殖，对自身造成损害。研究表明，人Viperin通过与人巨细胞病毒的vMIA相互作用，抑制线粒体3功能蛋白功能，导致细胞骨架解聚，从而增强人巨细胞病毒的感染性[17-18]。本试验结果显示，Viperin的C末端能够显著促进PEDV RNA在Vero E6上的合成，猪Viperin是否有类似机制有待于进一步的研究。

本试验成功构建了表达猪Viperin的各个功能区真核质粒，并探讨了Viperin各个功能区对PEDV复制的影响，结果显示过表达Viperin C末端显著促进病毒RNA的合成。该试验为进一步探索抗病毒蛋白调控PEDV增殖的机制提供了科学依据。