靳文娟 陈田甜 陈文普 谢娟平 杜燕 王赛

摘要 以超声辅助的水酶法/水代法提取工艺为基础，利用牡丹籽油和牡丹籽粗蛋白的乳化作用和牡丹籽粗多糖的水溶性，初步分离牡丹籽油和牡丹籽粗多糖。采用冷冻解冻破乳法得到了牡丹籽油和少量牡丹籽粗蛋白;牡丹籽粗多糖的水溶液利用D101大孔树脂层析和DEAE-52纤维素柱层析联用，脱色纯化分离，得到偏中性和酸性的牡丹籽多糖。实现了牡丹籽油、牡丹籽粗多糖和少量牡丹籽粗蛋白的提取分离，并分别采用气相色谱法、苯酚硫酸法、凯氏定氮法测定了其含量。结果表明：综合提取工艺操作简单、成本低，得到的牡丹籽油亚麻酸和亚油酸的含量分别为199～216、178～182 g/kg;牡丹籽粗多糖得率为100.1～123.4 g/kg，牡丹籽粗蛋白得率为65.8～66.2 g/kg。

关键词 牡丹籽油;牡丹籽粗多糖;提取分离;含量测定

中图分类号 TS229 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）01-0146-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.039

Abstract Used the emulsification of peony seed oil and crude protein and the water solubility of the crude polysaccharide of peony seed to preliminarily separate the crude polysaccharide and oil in the peony seed which was based on the ultrasonic assisted aqueous enzymatic/aqueous extraction process.Peony seed oil and a small amount of crude protein of peony seed were obtained by freeze-thaw demulsification method.The aqueous solution of the crude polysaccharide of peony seed was decolorized and separated by D101 macroporous resin chromatography and DEAE-52 cellulose column chromatography.And then obtained the neutral and acid polysaccharide of peony seed.The extraction and separation of peony seed oil，peony seed crude polysaccharide and a small amount of peony seed crude protein were realized，and their contents were determined by gas chromatography，phenol sulfuric acid and Kjeldahl method respectively.The results showed that the comprehensive extraction process was simple and low-cost，the contents of linoleic acid and linoleic acid in peony seed oil were 199-216 g/kg crude oil and 178-182 g/kg crude oil，respectively; the yields of crude polysaccharide and crude protein were 100.1-123.4 g/kg and 65.8-66.2 g/kg，respectively.

Key words Peony seed oil;Peony seed crude polysaccharide;Extraction and separation;Content determination

油用牡丹是一种新兴的木本油料作物，在我国已广泛种植，近年来，在牡丹籽油市场需求的拉动下，油用牡丹的种植面积也在逐年扩大，牡丹主产区的种植面积有望在 5～10 年超过20万hm2[1]，而每公顷油用牡丹约可产出3 750 kg牡丹籽，高产量促进了牡丹籽综合开发利用研究。目前，牡丹籽除用于提取牡丹籽油[2-3]外，提取剩余物牡丹籽粕的加工利用也逐渐被重视，有研究报道[4]牡丹籽粕含有大量的营养物质，按含量高低依次为粗脂肪、粗蛋白、可溶性多糖、纤维、氨基酸、微量元素等。牡丹籽多糖作为一种植物多糖，具有多种生理活性，应用前景广泛[5-7]。文献报道中多以牡丹籽油提取后的牡丹籽粕为原料，提取牡丹籽多糖，但常用的牡丹籽油提取工艺，如溶剂浸提法、压榨法等，未考慮对其他活性成分的影响，其提取纯化过程可能会造成其他营养物质变质损失。水酶法和水代法具有操作条件温和、无有机溶剂污染、高效绿色的特性，为牡丹籽油和牡丹籽多糖等营养成分同时提取提供了基础。

该研究以牡丹籽油和牡丹籽粗多糖的综合提取为目的，以超声辅助的水酶法和水代法为基础，设计了提取路线。该研究设计的提取工艺，综合考虑了牡丹籽油和牡丹籽粗多糖的特性，以水为溶剂，利用各物质不同的溶解特性，设计提取分离工艺，成本低、易于操作，为牡丹籽油、牡丹籽多糖的同时提取分离提供了绿色简单的工艺路线，以期为促进油用牡丹籽的综合开发利用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

油用牡丹籽购于安康市旬阳县江森源实业有限公司;亚麻酸甲酯标准品、亚油酸甲酯标准品、中性蛋白酶购于北京索来宝生物科技有限公司;浓盐酸、浓硫酸、硼酸、氢苯酚、氧化钠、氯化钠、无水硫酸铜、硫酸钾、无水乙醇、石油醚（30-60）、无水甲醇均为分析纯，购于天津百世化工有限公司;D101大孔吸附树脂、DEAE-52纤维素购于北京华迈科生物技术有限责任公司。

CM-0406型离心机，上海医疗器械有限公司;WR-50微型粉碎机，天冠仪器仪表有限公司;KH2200E型超声波清洗器（超声频率40 kHz，超声功率80 W，加热功率600 W），昆山禾创超声仪器有限公司;RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器设备有限公司;SP-1900型双光束紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司;UPT-K1600自动凯氏定氮仪，北京优谱通用科技有限公司;GC5890N型气相色谱仪，南京科捷分析仪器有限公司。

1.2 方法

牡丹籽油、粗蛋白、粗多糖综合提取工艺流程见图1。

1.2.1 牡丹籽油和牡丹籽蛋白的提取分离。

1.2.1.1 牡丹籽的炒制与粉碎。将牡丹籽半破壳（用剪刀剪一条缝），与1.5倍体积的砂石混合，铁锅小火炒制10 min后，筛分去除砂石，牡丹籽去壳，粉碎过65号筛（250 μm）备用[8]。

1.2.1.2 水酶法和水代法提牡丹籽油。

牡丹籽油的提取分别采用水酶法和水代法。水酶法[9-10]提取工艺条件：取20 g炒制过的牡丹籽粉末，以料液比1∶25加入蒸馏水，调节pH=7，加入0.2 g中性蛋白酶，机械搅拌800 r/min ，超声辅助温度45 ℃、提取时间60 min，提取2次后，升温到65 ℃灭活中性蛋白酶。

水代法[11-12]工艺条件：取20 g炒制过的牡丹籽粉末，以料液比1∶25加入蒸馏水，机械搅拌800 r/min，超声辅助温度45 ℃、提取时间60 min，提取2次合并滤液。

1.2.1.3 乳液层的破乳分离。

采用破乳效果好且操作简单的冷冻解冻破乳法[13]：提取完成后，浑浊液4 000 r/min离心10 min，可分为3层，收集上层，水包油的白色乳液状，冷冻过夜后，室温下解冻，4 000 r/min离心10 min，分层，胶头滴管吸取上层油层，即为牡丹籽油，收集下层沉淀。重复冷冻—解冻—分离操作3次，合并提取物。

1.2.2 牡丹籽多糖的提取及纯化。D101大孔树脂和DEAE-52纤维素预处理[14-15]后装柱。

将牡丹籽油提取后离心过的中层水相，浓缩至10 mL后上样至D101大孔吸附树脂层析柱，用蒸馏水和5%的乙醇溶液洗脱，流速1 mL/min，收集洗脱液。洗脱液减压浓缩至20 mL后上样至DEAE-52纤维柱，分别用蒸馏水，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液依次洗脫，洗脱液分别减压浓缩至20 mL，用苯酚硫酸法测定其多糖含量。

1.3 含量测定

1.3.1 牡丹籽油脂肪酸甲酯含量及蛋白质含量的测定。乳液层破乳后所得牡丹籽油的中亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯含量用气相色谱测定[16];白色沉淀中蛋白质含量采用凯氏定氮法测定[17]。

不同方法提取得到的牡丹籽油样品的预处理：取400 μL油样于10 mL磨口试管中，加入400 μL乙醚-石油醚（1∶1）混合液，30 ℃下振荡摇匀，再加入200 μL 的KOH-CH3OH溶液（0.4 mol / L），摇荡使油脂全部转化为脂肪酸甲酯，静置15 min后加入少许蒸馏水，静置分层后取上层液，过0.45 μm有机滤膜后，用气相色谱分析脂肪酸含量。气相色谱条件：ZNOWAX毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）;载气为高纯度的氮气;升温程序为以 10 ℃/min 升温至 120 ℃，保持 2 min，再以8 ℃/min 升温到 240 ℃，保持 10 min;载气流速 1.6 mL/min;分流比 40∶1;进样量 1 μL。

1.3.2 多糖含量的测定。葡萄糖标准曲线的绘制：分别移取 0.1、0.2、0.4、0.6、1.2、1.6 、2.0 mL 的葡萄糖标准液（1 mg/mL）至 10 mL 容量瓶中，用去离子水定容。分别移取不同浓度系列葡萄糖溶液 2 mL 至棕色试剂瓶中，加入1.0 mL 苯酚溶液（6% ）和5 mL硫酸混合均匀，室温静置20 min后，用紫外分光光度计在 490 nm下测定吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

多糖含量的测定采用苯酚硫酸法[18]：取0.2 mL的多糖提取液（柱层析洗脱液）加入1.8 mL蒸馏水后，再分别加入1 mL苯酚溶液和5 mL硫酸溶液，混合均匀，室温静置20 min后，用紫外分光光度计检测其在490 nm（葡萄糖的最大吸收波长）处的吸光度。再根据葡萄糖标准曲线计算出多糖含量。

2 结果与分析

2.1 破乳后牡丹籽油得率和粗蛋白含量

提取工艺分别采用超声辅助的水酶法和水代法。结合参考文献[9]中对水酶法提取工艺中不同酶制剂的研究结果，选择提取率仅次于碱性蛋白酶的中性蛋白酶，不仅可促进蛋白质水解释放油脂，而且在中性条件下不影响牡丹籽多糖的性质。水代法和水酶法提取液中，上层乳液层经多次冷冻-解冻破乳后，可释放出牡丹籽油，同时得到少量粗蛋白。由表1可知，水酶法比单纯的水代法牡丹籽油的得率高16.34%[牡丹籽油得率=牡丹籽油的质量/牡丹籽粉末的质量（20.00 g）]。由于蛋白质具有乳化性，易和油形成水包油的乳液，所以破乳分离牡丹籽油后，得到的白色沉淀中含有牡丹籽粗蛋白，凯氏定氮法测得水酶法和水代法得到的白色沉淀中，牡丹籽粗蛋白的含量分别为65.8、66.2 g/kg，测得原料（炒制的牡丹籽粉末）中牡丹籽粗蛋白的含量为165 g/kg。

以亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯为标品，采用单点校正法测得的水酶法和水代法提取的牡丹籽油中亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯的含量如表2、3所示，水酶法提取的牡丹籽油的总质量为2.478 g，其中亚油酸的含量为182 g/kg、亚麻酸的含量为216 g/kg;水代法提取的牡丹籽油的总质量为2.129 g，其中亚油酸的含量为178 g/kg、亚麻酸的含量为199 g/kg。

2.2 牡丹籽多糖含量

超声辅助的水酶法和水代法提取液中，褐色的中间层富含水溶性的牡丹籽粗多糖，为了祛除色素体高纯度，特选取脱色效果较好的D101大孔树脂脱色处理，用蒸馏水和5%乙醇溶液洗脱，分别收集洗脱液，采用苯酚硫酸法依据图2所示的葡萄糖标准曲线，测得水酶法提取液中牡丹籽粗多糖共128.0 mg，水代法提取液中牡丹籽粗多糖共156.1 mg。选用DEAE-52纤维柱进一步纯化牡丹籽粗多糖，含量如表4、5所示，其中蒸馏水洗脱液中多糖含量最高，约占洗脱液中多糖总量的50%，说明牡丹籽粕的多糖中除酸性多糖外还有大量偏中性的多糖。水酶法和水代法提取液中牡丹籽粗多糖得率分别为100.1、123.4 mg/g（即100.1～123.4 g/kg）。

3 結论

该研究以牡丹籽油和牡丹籽粗多糖的综合提取为目的，设计提取路线，采用超声辅助的水酶法和水代法，利用牡丹籽粗蛋白和牡丹籽油易形成白色乳液的特性和牡丹籽粗多糖的水溶性，实现了牡丹籽油和牡丹籽粗多糖的初步分层，用冷冻解冻破乳的方法得到了牡丹籽油和少量牡丹籽粗蛋白;采用D101大孔树脂脱色和DEAE-52纤维素树脂联用，纯化了牡丹籽粗多糖，得到了偏中性的蒸馏水洗脱多糖和酸性的NaCl溶液梯度洗脱多糖。就所测得的牡丹籽油得率、品质（亚麻酸、亚油酸含量）、粗多糖提取量等参数而言，水酶法和水代法应用于此综合提取工艺中差别不大，相对而言，水代法操作更简单、成本更低，适合于工业化应用。

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