郭菊玲++杨勇帮++蒋春艳

摘要：目的建立系统、科学的火把花根中雷公藤甲素的提取和含量测定的方法，为科学评价和有效控制火把花根的质量提供了可靠的方法。 方法采用高效液相色谱法，色谱柱为Agilent Venusil PLOW-C18柱（4.6×150 mm，5 um）；流动相为水-甲醇；流速为1.0 mL/min；检测波长为217 nm；柱温为35℃。 结果火把花根中雷公藤甲素的峰得到有效的分离，HPLC检测条件、方法的专属性、线性、重复性、精密度、稳定性、回收率良好，该方法可以用于雷公藤甲素的含量测定。 结论该方法对今后的火把花根的质量控制和科学评价提供了参考依据。

关键词：火把花根；雷公藤甲素；HPLC；含量测定

中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：1007-2349（2016）11-0071-04

火把花根又名昆明山海棠[Tripterygium hypoglaucum（Levl.）Hutch.]是卫矛科（Celastraceae）雷公藤属[Tripterygium Wilfodii（Hook.）f.]落叶披散或蔓状灌木植物，又名雷公藤、断肠草、紫金皮、掉毛草、六方藤等。生长于向阳山坡、路边或灌木丛中，通常作为药用的部位为根和皮，昆明山海棠为中国特有的植物，民间药用中草药。主要分布于我国的西南地区，云南省境内尤为多见，主要集中分布于昆明、楚雄、红河、玉溪等地。火把花根彝语为“一姑妹班”、“多争唯”意译为“开花像火把样通红的植物。在西南地区彝族药用历史悠久。主要用于治疗慢性肾炎、类风湿性关节炎、红斑狼疮等。火把花一名始载于《本草纲目》，李时珍集解曰：“生滇南者花红，呼为火把花。[1]昆明山海棠有效成分研究多有报道，但是其含量测定研究少见。火把花根药材收载于《云南省药品标准》（1974年）、《云南省中药材标准》第二册·彝族药（2005年）。现行《中国药典》收载的昆明山海棠片以重量法进行含量测定，且测定方法相对简单，检验灵敏度、重现性还有待提高[2]。上述标准中均无火把花根药材的含量测定项目，有必要对此项目进行研究。

火把花的化学成分较为复杂，长期研究发现火把花中含有生物碱类雷公藤碱（wilfordie）、雷公藤次碱（wilfori）、雷公藤甲素（Triphonide）等，其中最主要的活性成分为雷公藤甲素。[3]雷公藤甲素为环氧二萜类内脂化合物，其药理作用为：抗排斥作用、抗肿瘤作用、抗生育作用等。[4]雷公藤甲素有较强的抗肿瘤活性，并具有广谱、高效等特点，可以用于类风湿性关节炎、强直性关节炎等多种自身免疫疾病和炎性疾病的治疗。[5]目前，对于火把花根中的雷公藤甲素的含量测定方法已经有文献报道，但是由于研究的方法不够完善和统一，得出的结果差异性较大。因此，本次研究在现有的火把花根中雷公藤甲素的含量测定的基础上，运用HPLC色谱法，对火把花根药材进行了一系列的试验，建立了一个对火把花根中雷公藤甲素进行含量测定的方法，为以后科学评价和有效控制雷公藤药材的质量提供了可靠的科学依据。

1仪器与试药

1.1仪器安捷伦1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司真空在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、UV检测器），赛多利斯BSA224S-CW电子天平，赛多利斯BP211D电子天平，DHG-9104型鼓风干燥箱，KQ-500E型超声波清洗器，YS-04A小型高效粉碎机，Agilent Cary 60 UV-Vis紫外分光光度仪。

1.2试药雷公藤甲素对照品（中国食品药品检定研究院）批号为：111567-201404，标示量为：99.8%；分析纯：甲醇（四川西陇化工有限公司）、三氯甲烷（四川西陇化工有限公司）、乙醚（四川西陇化工有限公司）、乙酸乙酯（四川西陇化工有限公司）、中性氧化铝（国药集团化学试剂有限公司，200-300目），批号为：20130328色谱纯为甲醇（德国默克试剂公司）；水为超纯水。

2方法与结果

2.1薄层色谱鉴别取本品粉末约5 g，加80%甲醇30 mL，超声30 min，放冷至室温，滤过，取滤液。滤液加三氯甲烷振摇提取3次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，并将滤液低温蒸干。残渣加5ml甲醇完全溶解后用含5 g中性氧化铝的洗脱柱（内径为1.2 cm，200目），洗脱液为甲醇：乙酸乙酯：乙醚=1：2；1 60 mL进行洗脱至无色，蒸干洗脱液，残渣加1 mL甲醇溶解作为供试品溶液。另取雷公藤甲素对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取上述两种溶液各10 uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷—乙醚（2：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%3，5—二硝基苯甲酸乙醇溶液与2mol/l氢氧化钠乙醇液的混合液（临用前按1：3混合）作为显色剂，喷雾显色，自然光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2.2检测波长的确定取雷公藤甲素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作为雷公藤甲素对照品溶液。取雷公藤甲素对照品溶液经紫外分光光度仪进行波长扫描，最大吸收波长为217 nm。结果如图1，由图1可知，雷公藤甲素的检测波长为217 nm。图1雷公藤的全波长扫描图谱

2.3色谱条件与系统适应性色谱柱：Agilent Venusil PLOW-C18柱（4.6×150 mm，5 um）；流动相：甲醇-水（40：60）检测波长：217 nm柱温：35℃；流速：1 mL/min；进样：10 uL；分析时间：40 min。

2.4溶液的制备

2.4.1对照品溶液的制备对照品溶液制备：取雷公藤甲素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.4.2供试品溶液的制备供试品溶液的制备：取本品粉末（过三号筛）约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率50kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液移置分液漏斗中，加水7 mL，用氯仿振摇提取3次，每次15 mL，合并氯仿液，蒸干，残渣转移至中性氧化铝柱用60 mL洗脱液进行洗脱（中性氧化铝：5 g；洗脱柱内径：1.2 cm；洗脱液体积：60 mL；洗脱液：甲醇-乙酸乙酯-乙醚=1∶2∶1），收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5方法学考察

2.5.1专属性考察在检测波长：217 nm；柱温：35℃；进样量：10 uL；流动相：甲醇-水（40：60）；的HPLC色谱条件下，将雷公藤甲素对照品溶液、样品溶液进行HPLC分析，得到相应的色谱图。结果如图2所示，对照品的保留时间与样品的保留时间一致，说明该检测条件、方法专属性良好。图2雷公藤样品图谱

2.5.2线性关系考察取雷公藤甲素对照品，分别配制成浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的对照品溶液，进行高效液相色谱分析，以进样浓度（mg/ml）为横坐标，峰面积（mAU*s）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=20507X-6.3579，R2=0.9999，结果见表1。实验结果表明在进样浓度为0.01mg/ml～0.06mg/ml的范围内，线性关系良好。

2.5.3重复性考察按照供试品溶液的制备方法重复处理六份供试品溶液，进样10 uL，进行高效液相色谱法检测，并记录雷公藤甲素的峰面积，结果见表2，由检测结果可知RSD%<3%，表明高效液相色谱法检测条件、方法的精密度良好，可用于雷公藤甲素的含量测定。

2.5.4精密度考察精密吸取同一对照品溶液，进样10 uL，平行进样5次，记录雷公藤甲素色谱峰的峰面积，计算RSD%值。结果见表3，可知RSD%<3%，表明HPLC检测条件、方法的精密度良好，可用于雷公藤甲素的含量测定。

2.5.5稳定性考察取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、18、20、24 h进样10 uL，并记录雷公藤甲素的峰面积，带入Y=20507X-6.3579，R2=0.9999计算含量，计算RSD%值为1.74%，结果显示此方法样品24 h内稳定性良好。

2.5.6回收率试验分别精密称取已知含量（0.0186 mg/g）的供试品3个重量梯度共6份，分为3组，每组两份，配制一个浓度（0.02 mg/mL）的雷公藤甲素对照品溶液，分别向样品溶液中加入3.4 mL、4.65 mL、5.6 mL的标准品溶液。将上述6份样品分别样品分别进样10 μL进行HPLC分析，测定雷公藤甲素的峰面积，计算相应回收率及RSD%值。结果为：平均回收率为98.9%，RSD%为1.80%，表明该HPLC检测条件、方法的可靠性强。结果见表5。

3讨论

（1）火把花根的化学成分复杂，而且雷公藤甲素的本身含量极低，用普通的提取方法很难将雷公藤甲素从火把花根中提取出来，大量文献报道的测定方法很少有给出色谱图，有色谱图的雷公藤甲素的峰面积较小且分离度不够，本次研究通过大量的试验，发现用氯仿萃取后通过中性氧化铝柱层析，加洗脱液进行洗脱后，雷公藤中雷公藤甲素的得到了很好的分离。调整洗脱液的用量，雷公藤甲素洗脱完全，雷公藤甲素的含量也明显增加。此次研究反复多次对样品前处理方法进行来探索，为使用HPLC法测定火把花根中雷公藤甲素的含量打下了坚实的基础。该含量测定方法对今后的火把花根的质量控制和科学评价提供了参考依据。

（2）含量测定方法确立的过程中，样品前处理至关重要。前期薄层色谱筛查的时候，因为样品中雷公藤甲素含量很低，但其又是药理活性成分。所以选其为质控目标物。纵观整个样品处理过程对药品企业药品生产工艺有实际指导意义。民族民间使用火把花根大多以酊剂，以用乙醇溶液浸泡的形式出现，药效显著；使用汤剂的很少。本次研究中，也用过水以及不同的甲醇溶液进行提取。最终发现用甲醇提取时，雷公藤甲素的提取效率最大。这就提醒我们从事传统民族民间药物的现代工艺开发研究一定要尊重传统民间医药的用药习惯，才能有的放矢。才能真正推动民族药的发展。

参考文献：

[1]张航行，耿会玲，杨维霞.昆明山海棠的化学成分及药理活性研究进展[J].中草药，2012，23（6）：42-44.

[2]卫生部.中国药典[S].北京，化工出版社，2015.1056.

[3]王贤英、谢香菊、李胜容.中药材火把花中雷公藤甲素及表儿茶素的含量测定[J].重庆中草药研究，2012，1（65）：17-21.

[4]刘劝，王友群.雷公藤甲素的药理作用研究[J].中国药科大学药理研究室，2005，29（4）：156-161.

[5]陈江飞，胡毅坚，苗彩云.雷公藤甲素药理作用研究进展[J].中国医药工业杂志，2007，38（8）：604-606.