谷长维，胡博

中国农业科学院特产研究所农业农村部经济动物疫病重点实验室，吉林 长春 130112

A 组轮状病毒（group A rotavirus，RVA）为呼肠孤病毒科家族成员之一，是世界婴幼儿胃肠炎的主要诱因。2016年，RVA导致全球128 500名5岁以下儿童死亡，给许多国家带来了巨大的经济负担［1］。轮状病毒疫苗其防控效果明显［2-4］，但疫苗的选择压力可能会造成流行毒株的改变。RVA基因组有11个双链RNA基因片段，编码6个结构蛋白（VP1～VP4、VP6、VP7）及 6 个非结构蛋白（NSP1 ～ NSP6）［5］。半巢式多重PCR技术是目前常用的RVA基因分型方法，特别是GOUVER等［6］报道的VP7引物仍在世界范围内使用。2015—2017年全国流行病学传染病监测（The National Epidemiological Surveillance of Infectious Disease，NESID）数据显示，RVA的VP7基因型的鉴定方法约50%是基于测序，其余是基于多重PCR。

本研究根据GenBank上登录的RVA VP7基因5′端保守区，设计一系列VP7特异性引物，建立半巢式多重PCR检测方法，以期为轮状病毒感染的监测、诊断及治疗提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 毒株 RVA 毒株 SP15-09（Wa-like G1P［8］）、NT036（Wa-like G1P［8］）、SP15-06（DS-1-like G1P［8］）、To16-04（G2P［4］），KN105（Wa-like G3）、To16-01（equine-like，DS-1-likeG3）、OH279（G4P［8］）、TA15-07（G8P［8］）、To14-25（G9 lineage3）、To16-02（G9 lineage 6）及NS17-5（G12）均由日本北里生命研究所惠赠（已测序，基因分型已确定）。

1.2 主要试剂 Premix Ex TaqTMHot Start Version购自日本TaKaRa公司；无DNase／RNase水购自北京索莱宝生物科技有限公司；RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 半巢式多重PCR法对VP7基因分型 根据Gen-Bank中RVA VP7基因5′端保守区设计合成多组基因分型引物，引物序列见表1。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。采用RNA提取试剂盒分别提取11个RVA株病毒RNA，进行RT-PCR（第1轮PCR）。反应前，RNA样品和第1轮PCR引物对于65℃孵育5 min。第1轮PCR反应条件：50℃ 30 min，94℃2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共 40 个循环；72℃延伸5 min。第1轮PCR产物用无DNase／RNase水稀释50倍，取2 μL稀释液作为多重PCR（第2轮PCR）样品，第2轮PCR使用第2轮PCR引物在Premix Ex TaqTMHot Start Version试剂上进行。……