任丽萍，邵玉平，陈涛，王艳，方兴，韩悦，姚文清

辽宁省疾病预防控制中心，辽宁 沈阳 110005

急性弛缓性麻痹（acute flaccid paralysis，AFP）病例定义为所有15岁以下出现AFP症状的病例及任何年龄临床诊断为脊髓灰质炎的病例均作为AFP病例。引起儿童AFP的病原除脊髓灰质炎病毒外，还包括肠道病毒A组71型（EV-A71）、柯萨奇病毒、埃可病毒等非脊髓灰质炎肠道病毒（non-polio enterovirus，NPEV）［1］。EV-A71 属小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus）A 组肠道病毒［2］，该病毒除引起AFP外，还可引起手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎等［2］。近年来EV-A71多与手足口病的暴发相关，是引起手足口重症病例的病毒类型［3］。至2015年，EV-A71被分为7个基因型（A～G）和14个基因亚型［3-5］，其中，中国内地的C4基因亚型分为C4a及C4b 2个进化分支［4-5］。

本文对2009—2018年辽宁省AFP病例中EVA71分离株进行VP1基因特征分析，旨在为辽宁省AFP监测提供病原学依据。

1 材料与方法

1.1 标本 病例来自2009—2018年辽宁省AFP监测系统，14 d内的麻痹病例双份粪便标本由县区疾控中心采集，7 d内送至辽宁省疾控中心脊灰实验室，-20℃保存。

1.2 细胞及毒株 横纹肌肉瘤RD细胞及转脊灰病毒受体的小鼠肺L20B细胞均由中国疾病预防控制中心病毒病所脊灰实验室提供；EV-A71原型株（U22521_BrCr／1970／A）及EV-A71 C4亚型的C4a分支（FJ469153_BJ／CHN／2008／C4a）均从GenBank下载。

1.3 主要试剂及仪器 QIAGEN RNeasy Mini Kit试剂盒、One Step RT-PCR Kit试剂盒及QIAquick Gel Extraction Kit胶纯化试剂盒均购自德国QIAGEN公司；Big Dye Terminator V3.0 Cycle Sequencing kit试剂盒及ABI3100测序仪均购自美国ABI公司。

1.4 病毒分离 根据WHO《脊髓灰质炎实验室手册》［1］及补充资料，用L20B细胞及RD细胞对粪便标本进行病毒分离，RD细胞呈阳性而L20B细胞呈阴性的为NPEV。

1.5 RT-PCR扩增 用QIAGEN RNeasy Mini Kit试剂盒提取病毒RNA。引物为EV-A71特异性引物2386S 及 011［6］，上游引物 2386S：5′-CTATGAAGTTGTGTAAGGAT-3′；……