王 鹏，秦红霞，田一博，李萌萌，焦佳伟，孙艺文，王世广

0 引 言

造成5岁以下小儿重症腹泻的主要原因之一为轮状病毒(rotavirus, RV)感染，且在发展中国家发生率更高，威胁着全世界婴幼儿的健康甚至生命[1]。肠道分泌与吸收之间的平衡失调即会导致腹泻的发生[2]。钠-氢交换蛋白(Na+/H+exchanger，NHE)3型参与多种肠道生理病理学过程，哺乳动物肠道上皮细胞刷状缘膜表面为其主要表达部位，与肠道Na+和水的吸收密切相关。当小鼠NHE3基因敲除后，肠道Na+和水的吸收减少，产生腹泻症状[3]，与之相似，霍乱毒素或炎性肠病也可明显抑制NHE3蛋白的量和生物活性，诱发腹泻[4]。研究发现，细胞内吞和/或胞吐率的改变可急性调控NHE3蛋白的量和生物活性，且50 %NHE3的转运调控是胆固醇依赖性，属于Rho蛋白家族的Cdc42分子，参与调控胆固醇依赖性的细胞内吞/胞吐进程[5-6]。本研究利用脂筏破坏剂甲基-β-环糊精(methyl-β-cyclodextrin，MβCD)，在表达NHE3单层极化Caco-2细胞模型的基础上，研究RV感染对细胞表面NHE3蛋白的量连同生物活性是否与脂筏介导的Cdc42依赖性内吞通路的调控有关，从而为实现RV感染性腹泻的靶向治疗和药物开发提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂抗鼠Cdc42抗体、抗鼠HA抗体、抗兔GAPDH抗体、HOE694和BCECF-AM均购自Santa Cruz生物科技公司，FBS、DMEM细胞培养液购自Thermo Fisher 科技公司。Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 790)和Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa Fluor® 680)抗体购自Abcam公司。TRIzol试剂购自Invitrogen公司，Transwell细胞培养盘购自Corning 公司。Caco-2细胞购自中国科学院细胞库，其他实验用品购自Sigma-Aldrich 公司。

1.2方法

1.2.1 表达NHE3 的单层极化Caco-2细胞模型的构建HEK 293细胞内扩增腺病毒载体HA-NHE3，梯度CsCl纯化收集HA-NHE3腺病毒[7]。在……