晏雪梅，杨居崩，聂发龙，廖 陈，李秀芳

（云南中医药大学，云南 昆明 650500）

上呼吸道感染（URTI）为常见呼吸系统疾病，包括流行性感冒（简称流感）、普通感冒、病毒性咽炎等，URTI向下呼吸道迁延而出现的多种并发症是导致URTI患者致残或致死的重要原因。2018年，KWONG等[1]指出，急性心肌梗死与急性URTI尤其是流感之间关系密切，患者在确认感染流感后的前7 d，急性心肌梗死发作的概率可增加6倍。一项针对感染甲型流感（H7N9）幸存病例出院后2年的随访调查显示，50%的幸存者在感染治愈后的1年内仍存在严重的通气功能障碍[2]。由于80%以上的URTI由病毒感染引起，故接种疫苗和使用抗病毒药物是临床对因治疗最有效的手段。目前，临床常用的URTI抗病毒药物包括神经氨酸酶抑制剂、脱氧核糖核酸（RNA）聚合酶抑制剂和M2蛋白离子通道抑制剂。神经氨酸酶抑制剂由于耐药率相对较低，作用特异性较强，可阻碍病毒颗粒的释放，高效抗病毒。奥司他韦是神经氨酸酶抑制剂，可竞争性结合流感病毒表面的神经氨酸酶活性，干扰病毒从宿主细胞释放，阻碍病毒扩散，对甲型和乙型流感病毒具有较好的抑制作用。UYEKI[3]研究发现，奥司他韦可降低疾病的严重程度和死亡率。H1N1流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒等均可由呼吸道进入机体，引发疾病，覆盖于呼吸道的黏膜系统成为机体防御病毒、细菌等病原微生物经口鼻入侵的第一道防线。研究证实，呼吸道黏膜屏障结构破坏或功能低下与URTI密切相关[4]，提高呼吸道黏膜屏障的防御能力是防治URTI的重要途径。本研究中探讨了奥司他韦对寒冷刺激所致小鼠鼻黏膜免疫屏障功能低下（MNMBD）的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试药、仪器与动物

试药：磷酸奥司他韦颗粒（宜昌东阳光长江药业股份有限公司，批号为0581903053）；Mouse IgA Antibody（美国 Novus Biologicals公司，批号为 A30）；β -Actin Polyclonal antibody（批号为 00078629），GAPDH Rabbit Polyclonal antibody（批号为00044915），均购自美国 Proteintech 公司；干扰素λ受体 1（IFNLR1）Antibody（英国biorbyt公司，批号为 CB17514）；白细胞介素10Rβ（IL-10Rβ）Antibody（美国 Santa Cruz公司，批号为 D1015）；干扰素调节因子 9（IRF9）Antibody（美国 Cell Signaling 公司，批 号 为 288455）；Anti-IL-28A Antibody（批号为GR24656-5），Anti-黏病毒抗性蛋白 1（Mx-1）Antibody（批号为GR3190794-16），均购自美国Abcam公司。

仪器：Infinite M200 PRO型酶标仪（瑞士Tecan公司）；XS125A型分析天平（瑞士普利赛斯公司，精度为十万分之一）；HITACHI CF16RXⅡ型台式低速离心机（日本Hitachi Koki公司）；PowerPac U 型电泳仪、Mini-Proto型湿转仪，均购自美国伯乐公司；Bio Spectrum型UVP凝胶成像分析系统（美国Spectrum公司）。

动物：SPF级昆明种小鼠38只，雄性，体质量18～20 g，由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK（川）2015-030，合格证号为 51203500009727。饲养条件为光照12 h、黑暗12 h，温度18～22℃，相对湿度40%～60%。

1.2 方法

复制寒冷刺激致小鼠MNMBD模型[5-6]。

将小鼠随机分为正常组（12只）、模型组（12只）、奥司他韦组（14只）。正常组和模型组灌胃蒸馏水，奥司他韦组小鼠提前灌胃奥司他韦，临用时按临床成人等效量的2倍量（40 mg/kg）进行配制，每10 g体质量0.2 mL灌胃给药，1次/日，连续给药3次。正常组不予任何刺激；模型组和奥司他韦组小鼠均于末次给药30 min后置-20℃环境中1 h，再置25℃环境中30 min，循环刺激2次，造模后正常给予水和食物。于造模结束后24 h，过量麻醉，处死小鼠，摘取鼻黏膜，使用免疫印迹（Western Blot）法检测鼻黏膜组织中免疫球蛋白 A（IgA）、干扰素 λ（IFN-λ）、IFNLR1、IL-10Rβ、IRF9 和Mx-1蛋白表达水平。

模型组小鼠鼻黏膜组织中，IgA和IFN-λ蛋白表达水平与正常组相比，明显下降，若差异有统计学意义则判断为造模成功。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 对IgA蛋白表达的影响

结果显示，与正常组比较，模型组小鼠鼻黏膜组织中IgA蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，奥司他韦组小鼠鼻黏膜中IgA蛋白表达水平显著升高（P ＜0.01）。详见图 1 A。

2.2 对IFN-λ蛋白表达的影响[7]

结果显示，与正常组比较，模型组小鼠鼻黏膜组织中IFN-λ蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，奥司他韦组小鼠鼻黏膜组织中IFN-λ蛋白表达水平升高（P＜0.05）。详见图1 B。

2.3 对IFNLR1和IL-10Rβ蛋白表达的影响

结果显示，与正常组比较，模型组小鼠鼻黏膜组织中IFNLR1和IL-10Rβ蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，奥司他韦组小鼠鼻黏膜组织中IFNLR1蛋白表达水平呈升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），IL-10Rβ蛋白表达水平明显高于模型组（P＜0.01）。详见图1 C和图1 D。

2.4 对IRF9蛋白表达的影响

结果显示，与正常组比较，模型组小鼠鼻黏膜组织中IRF9蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，奥司他韦组小鼠鼻黏膜组织中IRF9蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。详见图1 E。

2.5 对Mx-1蛋白表达的影响

结果显示，与正常组比较，模型组小鼠鼻黏膜组织中Mx-1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，奥司他韦组小鼠鼻黏膜组织中Mx-1蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）。详见图1 F。

3 讨论

上呼吸道与外界直接相通，覆盖于除鼻前庭外鼻腔结构的鼻黏膜，始终暴露于病原菌、共生菌和环境化学物质等各种物质中，由鼻黏膜激发的免疫效应对于防御病原体经鼻进入机体至关重要。研究表明，鼻黏膜屏障结构遭到破坏或功能低下可为病原微生物的入侵和定植创造条件，是上呼吸道感染发生的重要原因之一[8-9]。分泌型免疫球蛋白A（sIgA）是黏膜免疫系统的主要效应分子，在机体第一线屏障中起重要作用，可防止病原体进入黏膜上皮，保护黏膜表面免受病原体和致病菌的侵害[10-11]。本研究结果显示，MNMBD模型小鼠鼻黏膜组织中IgA蛋白表达明显下降，给予奥司他韦后可显著促进小鼠鼻黏膜组织中的IgA蛋白表达，提示其可提高小鼠鼻黏膜免疫屏障功能。

注：与正常组比较，**P＜0.01，*P ＜0.05；与模型组比较，##P ＜0.01，#P ＜0.05。A.Ig A B.IFN-λ C.IFNLR1 D.IL-10Rβ E.IRF9 F.Mx-1图1 奥司他韦对MNMBD模型小鼠鼻黏膜组织中免疫屏障功能的影响Note：Compared with those in the normal group，**P ＜ 0.01，*P ＜ 0.05；compared with those in the model group，##P ＜ 0.01，#P ＜ 0.05.A.IgA B.IFN-λ C.IFNLR1 D.IL-10Rβ E.IRF9 F.Mx-1Fig.1 Effect of Oseltamivir on the immune barrier function in the nasal mucosa tissues of MNMBD model mice

IFN-λ是近15年才发现的特异性产生于黏膜组织的免疫效应分子，在抗病毒和免疫调节方面发挥重要作用，具有参与维持上呼吸道黏膜免疫屏障功能的重要作用，可通过诱导抗病毒蛋白的表达防止病毒侵袭，维持黏膜屏障功能的完整性。有研究显示，寒冷刺激可使IFN-β诱导的抗病毒反应下降[12]。本研究结果显示，反复的寒冷刺激可降低小鼠鼻黏膜IFN-λ蛋白表达。IFN-λ的受体为IFNLR1和IL-10Rβ的异源二聚体，IFN-λ与其受体结合，启动Janus激酶-信号转导及转录激活因子（JAK-STAT）信号级联反应，JAK-STAT信号转导通路是将细胞因子刺激信号经细胞膜进入细胞核内部的重要途径，IFN刺激基因的激活在细胞内建立抗病毒状态，促使抗病毒蛋白因子如2′，5′-寡聚腺苷酸合成酶（OAS）、核糖核酸依赖性蛋白酶（PKR）和Mx-1的释放，抑制病毒复制，发挥抗病毒作用[13]。可见，IFN-λ并非直接抑制或杀死病毒，而是通过启动相关抗病毒基因的表达，促使多种抗病毒蛋白的产生，从而发挥抗病毒作用[14-15]。Mx-1是关键的抗病毒效应因子[16-19]，Mx-1蛋白是IFN-λ关键的抗病毒效应蛋白[20-21]，是控制多种病毒的天然免疫系统的高度有效的抗病毒限制因子，可阻止病毒在细胞内的传播及复制。本研究结果显示，寒冷刺激后，小鼠组织中IgA，IFN-λ，IFNLR1，IL-10Rβ，IRF9，Mx-1 蛋白表达水平均下降。可见，寒冷刺激造成了小鼠鼻黏膜免疫屏障下降，这或许是受凉后易发生URTI的原因之一。给予奥司他韦干预后，可明显提高小鼠鼻黏膜 IgA，IFN-λ，IFNLR1，IL-10Rβ，IRF9，Mx-1 蛋白表达水平。可见，奥司他韦可提高寒冷刺激所致小鼠鼻黏膜免疫屏障的功能，作用机制与激活了小鼠鼻黏膜组织中IFN-λ相关信号通路有关。