李卓恒，卢来春

（1.重庆市医药高等专科学校药学院，重庆 401331；2.重庆大学生物工程学院，重庆 400044）

糖尿病（DM）是以高血糖为特征的代谢性疾病，全球发病率、死亡率逐年上升[1-2]。糖尿病肾病（DN）又称糖尿病肾小球硬化症，是糖尿病严重的微血管并发症，是导致终末期肾衰竭的重要病因[3-6]。DN治疗方法主要包括降糖、调脂、抗炎及抗氧化治疗等[7]。中医能通过个体化给药辨证施治，效果显著[8]，从中药中寻找治疗DN的药物是近几年的研究热点。牛蒡子是菊科植物牛蒡ArctiumlappaL.的干燥成熟果实，具有疏散风热、解毒消肿功效，其主要活性成分牛蒡子苷是其中含量最高的木脂素成分[9]。现代研究表明，牛蒡子及其提取物对慢性肾病、糖尿病、高血脂有显著改善作用[10-12]。本研究中探讨了牛蒡子苷对DN模型小鼠的改善作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：BC-2800Vet型全自动血液细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；XSZ-HS7型生物显微镜（重庆重光实业有限公司）；EL204型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，精度为0.000 1 g）；5417R型台式低温离心机（德国Eppendorf公司）；紫外分光光度仪（上海欣茂有限责任公司）；GB型罗氏血糖仪（德国罗氏公司）。

试药：链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司，货号为572201）；牛蒡子苷（实验室自制，纯度 ＞ 99.8% ）；超氧化物歧化酶（SOD）酶联免疫试剂盒（货号为 YX-051633M），丙二醛（MDA）酶联免疫试剂盒（货号为YX-130401M），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）酶联免疫试剂盒（货号为YX-071908M），总抗氧化能力（T-AOC）酶联免疫试剂盒（货号为YX-200118M），脂质过氧化物（LPO）酶联免疫试剂盒（货号为 YX-121615M），均购自上海优选生物科技有限公司。

动物：健康雄性 C57BL/6J小鼠 90只，体质量（20±2）g，购自陆军军医大学特色医疗中心实验动物中心，生产许可证号为SCXK（渝）2012-0005，实验动物质量合格证为No.11401300072698。饲养于陆军军医大学特色医疗中心实验动物中心，实验动物使用许可证号为SYXK（渝）2012-0010，实验动物的饲养和使用均符合中国《实验动物管理条例》。动物房温度18～22℃，相对湿度50% ～60%，明暗（12 h/12 h）交替，用小鼠全价饲料喂养。

1.2 方法

溶液制备：称取 1 g STZ，加入 10 mL 0.1 mol/L pH4.2的枸橼酸缓冲液中，即得1%STZ溶液。称取适量牛蒡子苷，加入0.25%羧甲基纤维素钠中，分别配成质量浓度为8，16，32mg/mL的溶液，即得牛蒡子苷溶液。

动物造模及模型成功判定标准：小鼠连续给予高脂、高糖饲料14 d后，禁食不禁饮12 h，腹腔注射质量浓度为70 mg/mL的STZ溶液。注射72 h后，于小鼠尾部采血，检测空腹血糖，连续3 d血糖≥8 mmol/mL为造模成功[13]；与正常小鼠比较，造模后小鼠血清中肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）升高，即为肾病模型成功。同时满足上述2个判断标准，即为DN造模成功。

动物分组及给药：取10只2月龄C57BL/6J型雄性小鼠作为对照组（A组）。将造模成功的小鼠分为模型组（B 组），卡托普利组（C 组，剂量为25 mg/kg），牛蒡子苷低、中、高剂量组（D1组、D2组、D3组，剂量分别为 80，160，320 mg/kg），每组 10 只，C 组、D1组、D2组、D3组每天灌胃相应药物，剂量为1 mL/kg，A组、B组给予等体积生理盐水，持续56 d，第57天处死小鼠。

1.3 观察指标

生化指标：小鼠处死前禁食不禁饮12 h，心脏取血，超量1.5%水合氯醛腹腔注射处死小鼠，全血不抗凝，静置 30 min，离心（3 000 r/min）15 min，取上层血清，-80℃保存，待测。全自动血液细胞分析仪检测小鼠Cr和BUN水平，并计算24 h尿蛋白/Cr比值；以酶联免疫吸附法检测小鼠肾脏匀浆中SOD，MDA，T-AOC，LPO，GSH-Px的水平。

脏器系数：小鼠处死前称体质量，处死后取左侧肾脏，并称定质量。肾脏系数=左侧肾脏质量/小鼠体质量。

日平均饮水量及日平均尿量：给药第55天，将各组小鼠放入代谢笼24 h，检测小鼠24 h内饮水量及尿量，计算平均值。

组织病理学：处死小鼠后，取肾脏，将其固定于4%多聚甲醛24～72 h，组织梯度脱水，石蜡包埋，5 μm厚度切片，分别用苏木精-伊红（HE）、Masson、六胺银染色，光镜下观察病理变化。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0统计学软件分析。组间比较行方差齐性检验，方差齐的数据采用 LSD检验，方差不齐的数据采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 改善体质量

与A组小鼠比较，B组小鼠体质量显著下降（P＜0.01）；与B组比较，C组、D1组、D2组、D3组小鼠体质量显著上升（P ＜0.01）。详见图 1。

2.2 改善血糖、肾功能、饮水量、尿量指标

与A组比较，B组小鼠脏器系数，平均日饮水量，平均日尿量，血糖，24 h尿蛋白 /Cr，Cr，BUN均显著上升（P ＜0.01）；与 B 组比较，C 组、D1组、D2组、D3组小鼠上述指标均显著降低（P＜0.01）。详见表1。

2.3 改善肾脏氧化应激指标

与A组比较，B组小鼠肾脏匀浆中MDA和LPO水平均显著上升（P ＜0.01），SOD，GSH-Px，T-AOC 水平均显著下降（P＜0.01）；与B 组比较，C 组、D1组、D2组、D3组小鼠MDA和LPO水平均显著下降（P＜0.05），SOD，GSH-Px，T-AOC 均显著升高（P＜0.05）。详见表2。

注：与 A组比较，**P＜0.01；与B组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。图1 各组小鼠体质量比较Note：Compared with those in group A，**P ＜ 0.01；compared with those in group B，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01.Fig.1 Comparison of the body mass of mice in each group

2.4 改善肾脏病理变化

HE染色显示，A组小鼠肾小球饱满，无坏死；B组小组肾小球萎缩，肾小管排列疏松，有空泡，周围炎性因子浸润较多。Masson染色显示，A组小鼠肾纤维化较少（蓝色染色较少），B组小鼠肾纤维化严重。六胺银染色显示，A组小鼠肾小球基底膜黑色染色较少，颜色浅，不连续；B组小鼠肾小球基底膜黑色染色较多，颜色深。与B组比较，C组、D1组、D2组、D3组小鼠肾小球较饱满，空泡、炎性因子、肾纤维化、肾小球基底膜黑色染色均较少，颜色较浅。详见图2。

3 讨论

中医理论认为，DN属“消渴”之“下消”。《杂病源流犀烛·三消源流》曰：“有消渴后身肿者，有消渴面面目足膝肿小便少者。”为虚实夹杂的糖尿病常见慢性并发证。消渴病日久不愈、耗气伤阴，导致肾元亏虚，“陈气”与内热相合，湿热、郁热、凌浊、疲血各种病理因素胶结，久之病变进入肾脏络脉之中而形成。《医学入门》中记载，“三消……熏蒸日久，气滞凝滞”即致瘀[14-16]，故气滞、气瘀和血瘀为DN病机的重要表现。

牛蒡子最早记录于《名医别录》，又称为恶实、鼠粘子等。李东垣《珍珠囊补遗药性赋》载“牛蒡味辛平无毒”“牛蒡子疏风壅之痰”，又载“鼠粘子味辛、平，性微寒；无毒。降也，阳也。其用有四：主风湿瘾疹盈肌；退寒热咽喉不利；散诸种疮疡之毒；利腰膝凝滞之气”。牛蒡子为解表药，利腰膝凝滞之气，可解陈气、血瘀。现代研究[17-18]表明，牛蒡子苷对糖尿病动物模型的血糖、血管等有显著改善作用。因此，本研究中将牛蒡子苷用于DN治疗。

DN早期的病理表现以肾小球基底膜增厚和系膜基质增多为主，晚期则多以弥漫性或结节性肾小球硬化为主。因此，本研究中除了观察糖尿病、肾病的血液指标外，还选择肾脏纤维化及肾小球基底膜改变作为判断给予牛蒡子苷后的改善指标。结果显示，牛蒡子苷对DN模型雄性小鼠的体质量、日饮水量、日尿量、血糖、血生化指标、肾脏指数、肾脏中氧化应激指标水平、肾脏病理变化均有显著改善作用。可见，牛蒡子苷剂量在80～320 mg/kg范围内对DN有显著改善作用，可能是通过调节肾脏氧化应激而起效。本研究结果为将牛蒡子苷开发为治疗DN的药物提供了理论和实验基础。

表1 各组小鼠脏器系数、饮水量、尿量、血糖、肾功能比较（±s，n=10）Tab.1 Comparison of organ coefficient，water intake，urine output，blood glucose and renal function of mice in each group（±s，n=10）

表1 各组小鼠脏器系数、饮水量、尿量、血糖、肾功能比较（±s，n=10）Tab.1 Comparison of organ coefficient，water intake，urine output，blood glucose and renal function of mice in each group（±s，n=10）

注：与 A 组比较，**P ＜0.01；与 B 组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01。下表同。Note：Compared with those in group A，**P ＜ 0.01；compared with those in group B，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01；as well as the following tables.

组别A组B组C组D1组D2组D3组肾脏系数（g/g×1 000）8.65±1.36 13.89±1.85**9.64±1.60##10.88±1.33##9.69±0.99##9.77±1.19##平均日饮水量（mL）5.62±1.04 8.51±1.27**7.30±1.06#7.97±1.33 7.66±0.84#7.06±1.17#平均日尿量（mL）2.24±0.59 4.9±1.14**3.72±0.75##4.80±0.76 4.26±0.50#4.04±0.69#血糖（mmol/L）5.37±0.53 12.7±1.98**9.03±1.50#11.01±1.48##9.80±1.41##9.44±1.03##24 h尿蛋白/Cr 21.81±5.03 128.50±24.95**67.07±8.22##92.11±10.61##82.07±6.97##88.67±11.98##Cr（μmol/L）38.3±5.88 68.1±8.55**49.8±5.69##54.8±6.43##52.7±4.36##52.4±6.70#BUN（mmol/L）12.18±2.24 19.02±1.98**15.56±1.02##16.56±1.02##15.96±1.09##16.8±1.03##

表2 各组小鼠肾脏氧化应激指标比较（±s，n=10）Tab.2 Comparison of oxidative stress indexes of kidney in each group（±s，n=10）

表2 各组小鼠肾脏氧化应激指标比较（±s，n=10）Tab.2 Comparison of oxidative stress indexes of kidney in each group（±s，n=10）

组别A组B组C组D1组D2组D3组MDA（nmol/L）3.52±0.99 9.14±1.89**4.64±1.24##6.19±1.30##5.55±1.11##5.42±1.10##SOD（U/mg）462.49±33.03 197.53±42.07**421.71±50.52##296.38±58.67##381.80±39.68##358.72±42.79##T-AOC（nmol/L）59.08±5.75 35.53±4.72**46.59±7.25#42.33±4.87#45.96±4.82#45.70±6.52#LPO（nmol/L）43.03±11.43 123.01±14.59**57.02±13.50##77.93±11.73##71.23±11.39##71.56±10.33##GSH-Px（U/kg）864.16±87.80 323.50±65.89**568.18±45.16##437.70±48.68##505.19±44.62##530.07±51.83##

图2 各组小鼠肾脏病理切片图a.group A b.group B c.group C d.group D1 e.group D2 f.group D3A.Changes of glomerular in mice（HE staining，×200） B.Changes of renal fibrosis in mice（Masson staining，× 200）C.Pathological changes of renal basement membrane in mice（Hexamine silver staining，× 200）Fig.2 Pathological sections of the kidney of mice in each group