符 炜，程向阳，刘 娣，刘 刚

脓毒败血症会导致病人发生急性肺损伤，继而引发重症监护室病人死亡风险增加[1-2]。丙泊酚对脓毒败血症诱发的急性肺损伤的保护作用已被证实[3]，但其机制还未阐明。研究[4]显示，核苷酸结合结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症体参与急性肺损伤的形成和进展。氧化应激反应参与了急性肺损伤的形成和进展[5]，硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)是关键的氧化应激衔接蛋白，TXNIP从硫氧还蛋白解离，结合NLRP3，激活NLRP3炎症体[6]。由于NLRP3具有促炎作用，抑制NLRP3能抑制炎症的形成和进展，而丙泊酚被认为主要通过抑制炎症反应发挥肺保护作用[3]。本研究观察抑制NLRP3信号通路对丙泊酚肺保护作用的影响，以探讨丙泊酚肺保护作用机制。现作报道。

1 材料与方法

1.1 实验动物 ICR小鼠40只，雄性，体质量20～24 g，由浙江省医科院实验动物中心提供，实验前适应性喂养1周，自由进食水。小鼠随机分为对照组(腹腔注射pH 7.4磷酸缓冲液)、脂多糖(LPS)组(腹腔注射30 mg/kg脂多糖)、丙泊酚组(静脉注射40 mg/kg丙泊酚)、丙泊酚+LPS组(腹腔注射30 mg/kg LPS前20 min预静脉注射40 mg/kg丙泊酚)，各10只。腹腔注射48 h后在七氟烷麻醉下颈椎脱位法处死小鼠。

1.2 方法

1.2.1 病理学观察 制作小鼠肺组织石蜡切片，置于烘箱中60 ℃烤1～2 h，石蜡切片常规二甲苯、乙醇脱蜡至水，苏木素染10 min，流水冲洗，去余色，0.7%盐酸乙醇分化数秒，流水冲洗，切片变蓝约15 min，95%乙醇30 s，乙醇性伊红染30 s，95%乙醇30 s(2次)，100%乙醇30 s(2次)，石碳酸二甲苯(1∶4)30 s，二甲苯30 s，中性树胶封片。采用100倍光学显微镜对肺部组织进行观察，细胞染色呈棕色为阳性细胞。

1.2.2 小鼠肺组织丙二醛(MDA)含量与超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 取ICR小鼠右侧肺部组织与预冷0.9%氯化钠溶液(M∶M=1∶9)混合，充分匀浆，在4 ℃、1 000 r/min离心15 min，制备上清液，根据MDA、SOD试剂盒操作说明书进行实验操作，利用分光光度计比色法测定其含量。

1.2.3 肺组织TXNIP mRNA和NLRP3 mRNA表达量 (1)总RNA提取：对20 mg肺组织匀浆处理，加入1 mL Trizol试剂裂解细胞，静置10 min，每毫升 Trizol试剂中加入0.2 mL氯仿溶液，震荡15 s，静置3 min。在4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取水样放置于EP管中，加入相同体积的异丙醇，混匀，常温放置50 min，在4 ℃、5 000 r/min离心3 min，吸出液体，常温下沉淀RNA，并用Rnase-free水对RNA沉淀进行溶解。(2)逆转录合成cDNA。采用SYBR Premix EX Taq Ⅱ预混酶(TakaRa公司)，按下列步骤操作。预混酶10 μL，上述cDNA模板1 μL，上、下游引物各10 pmol/L，加纯水至20 μL；AB 7300型实时荧光定量PCR仪(AB公司)，反应条件为：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，50个循环，采用溶解曲线分析程序分析产物的溶解曲线，以确认引物的特异性。

1.2.4 Western blotting印迹法检测肺组织中TXNIP和NLRP3蛋白表达 取肺部组织用液氮均匀研磨至粉末状，加入蛋白裂解液分解40 min，在冰浴条件下匀浆15 min，在4 ℃、14 000 r/min离心20 min，吸取上清液，Bradford法进行蛋白定量，将样品放置于-80 ℃冰箱中保存。取30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转至PVDF膜，一抗(Nrf2和HO-1稀释比例均为1∶ 100)在4 ℃封闭过夜；利用Tris缓冲盐对膜进行冲洗，约5 min，共冲洗3次，向反应体系中加入辣根过氧化物酶对二抗IgG(1∶2 000)进行标记，在常温下孵育60 min，采用Tris缓冲盐对膜进行冲洗，约5 min，共冲洗3次。利用β-actin作为内参，通过化学发光试剂进行显影，暗室曝光冲片，经胶片经凝胶成像系统确定TXNIP 和NLRP3蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 小鼠肺组织病理学观察 注射48 h后，对照组与丙泊酚组10只小鼠全部存活，LPS组4只、LPS+丙泊酚组6只存活。对照组与丙泊酚组小鼠肺组织结构较为正常，LPS组小鼠肺泡壁严重破坏，肺部组织毛细血管发生充血、扩张等现象，肺间质发生水肿，肺泡间隔变宽；丙泊酚+LPS组小鼠肺泡间隔轻度变宽，肺部组织损伤较LPS组减轻(见图1)。

2.2 各组小鼠右侧肺部组织SOD、MDA比较 腹腔注射48 h后，LPS组小鼠MDA明显高于对照组，SOD活性明显低于对照组(P<0.01)。丙泊酚组MDA、SOD与对照组差异均无统计学意义(P>0.05)。丙泊酚+LPS组MDA明显低于LPS组(P<0.01)，与对照组差异无统计学意义(P>0.05)；SOD活性明显高于LPS组(P<0.01)，但均明显低于对照组和丙泊酚组(P<0.01)(见表1)。

2.3 各组小鼠肺组织TXNIP mRNA和NLRP3 mRNA表达比较 丙泊酚组TXNIP mRNA和NLRP3 mRNA与对照组差异均无统计学意义(P>0.05)；LPS组TXNIP mRNA 和NLRP3 mRNA表达均较对照组和丙泊酚组明显上调(P<0.01)；丙泊酚+LPS组TXNIP mRNA 和NLRP3 mRNA表达均明显低于LPS组(P<0.01)，但仍均明显高于对照组和丙泊酚组(P<0.01)(见表2)。

表1 各组小鼠右侧肺部组织SOD、MDA比较

表2 各组小鼠肺组织TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA表达比较

2.4 各组小鼠肺组织TXNIP和NLRP3蛋白表达比较 丙泊酚组TXNIP和NLRP3蛋白表达与对照组差异均无统计学意义(P>0.05)；LPS组TXNIP 和NLRP3蛋白表达均明显高于对照组和丙泊酚组(P<0.01)；丙泊酚+LPS组TXNIP 和NLRP3蛋白表达均明显低于LPS组(P<0.01)(见表3)。

表3 各组小鼠肺组织TXNIP、NLRP3表达水平比较

3 讨论

炎症调节的细胞因子在急性肺损伤发生和进展中扮演着重要作用[7]，大量的肺泡巨噬细胞是肺组织天然的免疫细胞，急性呼吸窘迫综合征病人肺泡巨噬细胞产生过量的白细胞介素(IL)-1β和IL-18，应用IL-1β和IL-18中和抗体和IL-1受体拮抗剂能显著减弱机械通气诱发的急性肺损伤,机械通气激活NLRP3炎症体，NLRP3炎症体进一步诱发了肺泡IL-1β和IL-18的释放，因此NLRP3信号通路可能有助于机械通气诱发的急性肺损伤的发生[8-9]。

在LPS诱发的急性肺损伤模型中，LPS通过激活氧化应激反应间接激活NLRP3信号通路，氧化应激产物被证实参与了NLRP3信号通路的调节[10]。本研究结果显示，LPS明显上调小鼠肺组织TXNIP 和NLRP3 mRNA及蛋白表达。丙泊酚是临床常用全麻药物，在急性肺损伤气管插管病人镇静中的应用较广。丙泊酚在临床上可显著降低急性肺损伤发生风险，有学者指出丙泊酚对肺组织保护作用与氧化应激、炎性反应等有关，丙泊酚可清除羟基自由基与H2O2，诱导HO-1表达，抑制IL-6、TNF-α等炎性因子的表达，对脏器起到保护作用[11-13]。LUO等[14]研究表明丙泊酚对原位肝移植大鼠致急性肺损伤保护与抑制NADPH氧化酶相关，丙泊酚通过降低炎症反应与氧化应激反应实现肺组织保护效果。本研究结果显示，丙泊酚能明显减弱LPS诱发的肺组织氧化应激反应，虽然对正常肺组织TXNIP和NLRP3表达没有影响，但对LPS激活的NLRP3信号通路有显著抑制作用，提示丙泊酚抑制LPS激活的NLRP3信号通路可能与抑制LPS诱发的氧化应激反应有关。

综上，丙泊酚对LPS诱导的急性肺损伤的保护作用可能与抑制NLRP3信号通路有关。