廖 月， 何毅怀， 罗亚文

遵义医科大学附属医院 感染科， 贵州 遵义 563000

急性肝损伤是指既往肝功能正常的患者在6个月内出现肝生化指标快速改变，常由病毒感染、酒精、药物、毒物和代谢异常等原因引起，并存在一定的地域差异，在亚洲国家主要为肝炎病毒感染，在欧洲国家主要为酒精，是临床常见的危重急症之一。在急性肝损伤中，肝脏的合成、代谢和排泄功能受损，如果肝细胞功能损伤进一步加重或毒性产物增多，急性肝损伤患者出现黄疸、凝血功能障碍和肝性脑病等，可进展为急性肝功能衰竭[1]。正常情况下，体内氧化系统与抗氧化系统处于动态平衡状态，当各种因素导致体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)与抗氧化剂平衡紊乱，即产生氧化应激[2]。氧化应激参与肝损伤的发生和发展，被认为是急慢性肝脏疾病的病理生理基础，并与肝癌的发生密切相关[3]。急性肝损伤会引起细胞内的各种应激反应(代谢应激、氧化应激及内质网应激等)，而同样，持续应激将增加肝细胞损伤和死亡的风险，引起炎症和纤维化等肝脏疾病[4]。氧化应激可激活炎症反应和抗氧化反应，在急性肝损伤的发病机制中具有重要作用。

总之，了解氧化应激参与急性肝损伤的发生发展机制对临床研究和治疗至关重要。本文从氧化应激概述、氧化应激与损伤因素、氧化应激与肝损伤相关通路及潜在药物靶点进行综述，为了解急性肝损伤时氧化应激作用、影响及临床药物对其调控机制提供参考。

1 氧化应激

正常情况下，体内氧化系统与抗氧化系统处于动态平衡。但由于各种原因打破平衡将产生氧化应激，其中主要表现为ROS与抗氧化剂之间的失衡。ROS是含氧的分子，氧来源于O2的不完全还原。ROS主要包括细胞代谢的副产物超氧阴离子(superoxide anion，O2-)、羟基自由基(hydroxyl radical，HO-)、过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)。ROS过多会引起脂质自由基产生过多，如丙二醛(malondialdehyde，MDA)[2]。生理条件下，线粒体中进行氧化磷酸化过程以及合成必需的生物分子，可使ATP向细胞供能。在氧化磷酸化过程中，各种酶催化氧化还原反应并产生ROS。如果各种原因产生过多的ROS，引起氧化应激，出现线粒体功能障碍，最终将导致细胞自噬、坏死和凋亡等[5]。 ROS由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH oxidase，Nox)和黄嘌呤氧化物(xanthine oxide，XO)或线粒体电子泄漏产生。XO催化嘌呤代谢中黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化，导致O2-和H2O2的形成[6]。

ROS主要有两个来源，第一种途径是随着还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)和还原型黄素腺嘌呤二核苷酸(reduced flavin adenine dinucleotide，FADH2)的氧化磷酸化过程，分子O2在电子传递链(electron transfer chain，ETC)中被还原成H2O(图1)。ETC由整合到线粒体内膜的五种蛋白组成，包括复合体Ⅰ(NADH脱氢酶)、复合体 Ⅱ (琥珀酸脱氢酶)、复合体 Ⅲ (细胞色素c还原酶)、复合体 Ⅳ (细胞色素c氧化酶)和复合体 Ⅴ (ATP合酶)。三大营养物质代谢产物经三羧酸循环生成的NADH和FADH2分别经复合体 Ⅰ 和复合体 Ⅱ 线粒体各形成一对电子，复合体 Ⅰ 有4个质子转运出线粒体内膜，复合体 Ⅱ 不参与质子的转运。电子转移到Q循环，泛醌Q被还原为泛醌醇QH2，同时4个质子穿到线粒体内外膜间。QH2在复合体 Ⅲ 被氧化，电子通过细胞色素c转移到复合体 Ⅳ，分子氧接受电子还原为H2O，将消耗2个质子，因此此处仅2个质子转移至间隙。在这个过程中因线粒体内外膜之间的质子增多，势能增加，因此内膜上的线粒体解偶联蛋白(uncoupling proteins，UCP)将质子泵入线粒体基质，减轻线粒体膜的电势能。尤其是发生氧化应激时，线粒体会通过上调UCP2的表达以抵抗氧化应激。另一种途径是线粒体细胞色素催化循环，包括由广谱有机化合物组成的细胞色素P450酶，如脂质、类固醇和异生素，可产生各种反应副产物，如O2-和H2O2[7-10]。

图1 线粒体氧化磷酸化生成电子与抗氧化剂清除O2-的简要示意图

生理条件下，ROS参与了细胞增殖、免疫调节、应激相关反应信号传导过程、自噬和炎症等生理病理过程；而过量的ROS会导致细胞发生氧化应激和引起细胞代谢功能受损，并可通过直接破坏必需的蛋白质、DNA或脂质而直接引起细胞死亡或导致包括炎症在内的一系列疾病的发生[11]。

肝脏是ROS攻击的主要器官。肝实质细胞中的线粒体、微粒体和过氧化物酶体等可产生ROS，对于肝脏的正常生理功能十分重要；但肝脏中库普弗细胞、星状细胞等对氧化应激相关分子的敏感性更高。因此，当ROS产生过量，将会导致这些细胞迅速作出激活反应。氧化应激能诱导Kupffer细胞产生TNFα等细胞因子而促进细胞炎症和凋亡；氧化应激引起脂质过氧化从而引起肝星状细胞增殖和胶原合成，导致肝脏纤维化的发生和进展。总之，ROS水平升高超过生理量而抗氧化系统又不能及时清除时，将导致一系列疾病或症状的发生发展。

2 抗氧化系统

抗氧化系统内源性分子包括由酶组成的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases，GSH-Px)和非酶组成的维生素C、维生素E、尿酸、金属结合蛋白、多胺、胆红素、类胡萝卜素等，维生素E被认为是体内外均有作用，其他非酶成分暂认为是体外有作用[2,12]。抗氧化系统功能减弱将不利于肝脏恢复正常功能。有研究[13]表明，老年小鼠中谷胱甘肽(glutathione，GSH)恢复延迟导致氧化应激延长，抑制肝组织修复和肝细胞增殖，从而使肝损伤不易恢复。GSH是细胞中最丰富的硫醇，能直接与ROS反应。此外，GSH在由GSH-Px催化的反应中参与过氧化物还原，通常与肝损伤有关。肝脏中的抗氧化酶通常易受到各种因素的影响，包括应激、激素以及外源性物质[14]。利用氧化剂与抗氧化剂平衡对机体维持正常生理活动十分重要，而增加抗氧化系统活性已经是抗氧化治疗的研究靶点，未来或许有更重要的地位。

3 氧化应激与损伤因素

导致急性肝损伤的常见原因通常也会导致肝细胞氧化应激，如病毒感染(尤其是HBV)、酒精、药物等(图2)。若损伤因素持续存在，过度的氧化应激将导致慢性肝病发生，如酒精相关性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、纤维化和肝细胞癌等[15]。ROS的增多会引发不同类型的细胞死亡，包括坏死、凋亡、自噬等。因此，在许多肝病中，有效清除ROS、维持细胞氧化还原阶段是一条有效途径[16]。

图2 损伤因素与氧化应激简要示意图

3.1 氧化应激与肝炎病毒

3.1.1 氧化应激与HBV 肝炎病毒感染导致急性肝损伤在亚洲国家十分常见，尤其是HBV，其次为HCV，这两者均与氧化应激相关[3]。乙型肝炎中的氧化应激发生在多个层面，包括DNA氧化、蛋白质氧化、脂质过氧化以及ROS和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)的产生。在慢性HBV感染患者中，氧化应激血清指数(如HO-、O2-、H2O2等)增加，抗氧化剂血清指数(如总巯基、维生素C、尿酸、维生素E、胆红素等)减少。乙型肝炎感染患者中，随着疾病转为慢性，氧化应激增加，抗氧化值降低，提示氧化应激可能与HBV活动有关[17]。有学者[18]通过对296例慢性乙型肝炎患者氧化应激指标进行研究，发现HBV诱发的肝病患者存在氧化应激反应导致的肝损伤，损伤程度与HBV基因型及耐药性突变相关，提出氧化应激可能与患者HBV进展有关。这表明氧化应激不仅与HBV感染相关的肝病密切相关，且可能与HBV活动有关。因HBV具有强嗜肝性，主要攻击肝细胞[19]，如果能够深入探讨氧化应激与HBV之间机制的研究，且将抗氧化治疗作为乙型肝炎的辅助治疗，有望更好阻止HBV导致的急性肝损伤向肝衰竭或慢性肝病的方向发展。

3.1.2 氧化应激与HCV 氧化应激也参与HCV感染的发展，HCV的大多数蛋白都参与氧化应激的诱导[12]。有学者[20]纳入40名健康对照者和370例丙型肝炎相关性慢性肝病患者(分为120例血清酶正常的丙型肝炎患者、130例血清酶高的丙型肝炎患者以及120例肝硬化患者)，比较氧化应激标志物MDA、总过氧化物和氧化应激指数(oxidative stress index，OSI)，发现实验组数据均升高，肝硬化组最高。这表明随着丙型肝炎相关性慢性肝病程度的加重，氧化应激指标也升高，提示氧化应激参与了丙型肝炎的进展。

不但如此，当丙型肝炎合并其他感染或损伤因素时会加重氧化应激，并且氧化应激指标可能成为检测或诊断指标。例如，HCV感染患者饮酒过量，酒精在体内通过肝脏中细胞色素P450代谢，将导致ROS产生增多，激活氧化应激，HCV感染加重，肝损伤也将随之加重[21]。Gravier-Hernández等[22]通过病例对照研究分析了HIV合并HCV感染时氧化还原指标的变化。共纳入330例研究对象，分为健康对照组、HIV组和HIV-HCV组，检测其氧化还原、病毒学等指标，发现HIV-HCV组ROS及总过氧化物等均比健康对照组和HIV组升高，提示HIV-HCV合并感染时氧化应激较单独感染时重，在治疗合并感染时应注意抗氧化应激。由此可见，无论是丙型肝炎单独作用，还是其他因素联合作用，均与氧化应激相关，且在多因素作用的情况下，氧化应激加重。深入研究氧化应激和HCV之间的机制，并分析氧化应激与HBV、HCV之间的异同，将来或可在治疗病毒性肝炎中更好地运用抗氧化方案。

3.2 氧化应激与酒精性肝病 酒精也可通过激活氧化应激造成急性肝损伤。乙醇过量或中毒直接导致ROS和RNS的产生，从而打破肝细胞内氧化还原反应平衡[23]。Gou等[24]在小鼠3种急性肝损伤模型(分别由高脂乳剂、酒精和CCl4诱导)中发现，甘草总黄酮均可降低实验组小鼠血清ALT、AST水平及肝脏氧化剂MDA含量，且升高肝脏抗氧化剂SOD和GSH含量。这些结果表明，由酒精诱导的酒精性肝损伤产生了氧化应激，且可被甘草总黄酮抑制或减轻。

不但如此，氧化应激通过多种机制参与酒精性肝病的发展。长期饮酒将导致CYP2E1介导的酒精代谢增加，进而导致MDA、RNS和ROS等升高，这些物质通过脂质和蛋白质过氧化等介导肝损伤。除此之外，ROS也可诱导肝细胞线粒体结构和功能受损[25]。Wan等[26]在乙醇诱导的酒精性肝炎小鼠模型中发现，实验组小鼠体内MDA升高，反映实验组小鼠发生氧化应激；而注射TNFα刺激蛋白6(tumor necrosis factor-α-stimulated protein 6，TSG-6)后，与正常对照组小鼠相比，小鼠肝脏GSH显著增加，氧化应激减轻，TSG-6可以通过调控氧化应激来影响酒精性肝损伤进展。同样在乙醇诱导的酒精性肝病中，小鼠肝脏蛋白酪氨酸磷酸酶1B (protein-tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)被破坏后，乙醇诱导的损伤和氧化应激反应减轻[27]。以上表明氧化应激通过多种机制参与酒精性肝损伤的发生发展，而通过控制氧化应激可以减轻酒精性肝损伤。

3.3 氧化应激与药物或毒物性肝损伤 药物性肝损伤是指由处方药和非处方药引起肝功能损害或不良反应，常表现为氧化应激和细胞死亡，严重时可导致肝功能永久丧失和死亡[28-29]。部分药物性肝损伤是由于药物降低抗氧化剂水平，促进ROS在肝脏中累积和脂质过氧化水平增高而导致[30]。ROS将羰基引入氨基酸侧链，影响蛋白质的结构和功能；此外，脂质过氧化时，ROS还可能氧化多不饱和脂肪酸。线粒体膜内的脂质过氧化增加了膜渗透性，破坏了细胞膜和细胞器的完整性[14]。例如，CCl4可增加肝脏的氧化应激，导致肝细胞活性下降，抗氧化酶如CAT、SOD、GSH-Px和GSH等水平降低，而氧化应激生物标志物MDA水平增加[31]。在小鼠急性药物性肝损伤模型中[使用对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)，300 mg/kg]，APAP增加了脂质过氧化反应，APAP中毒的小鼠肝组织中酶类抗氧化剂和还原型GSH含量降低。但这种氧化应激可被波尔定碱(boldine)所治疗[32]。上述研究表明，药物在体内过多可引起氧化应激，氧化应激会破坏蛋白质结构和提高脂质过氧化水平加重肝损伤。氧化应激可能是药物性肝损伤治疗的潜在靶点或预防药物性肝损伤必须考虑的方面。

4 氧化应激与肝损伤相关通路及潜在药物靶点

4.1 氧化应激与Nrf2 Nrf2具有抗氧化、解毒和保护细胞等作用，90%以上的抗氧化基因受Nrf2调控，且调控主要是在翻译后水平进行[29, 33]。Nrf2作为抗氧化的重要调节因子，在细胞质内与Kelch 样品相关蛋白1(Kelch sample related protein-1，Keap1)结合形成复合物。氧化应激发生后，Nrf2和Keap1的复合物解离，Nrf2进入细胞核与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)结合，从而促进代谢酶/抗氧化蛋白质酶(CAT、GSH-Px和SOD等)的转录激活[34]。Senthil Kumar等[35]利用Lucidone预处理人肝癌细胞HepG2细胞，且使用乙醇刺激细胞诱导氧化应激后，发现Lucidone上调内源性抗氧化血氧合酶1(hemoxygenase-1，HO-1)的表达及激活Nrf2的表达，并且显著降低了HepG2细胞中MDA、ROS的水平和抗氧化剂GSH的耗竭。因此，提出Nrf2激活可降低细胞中MDA和ROS的水平，且此种效应可被药物Lucidone加强。此外，Gong等[36]利用乙醇诱导HepG2 C34细胞(不表达CYP2E1，为对照组)与HepG2细胞E47细胞(表达CYP2E1，为实验组)产生氧化应激，发现Nrf2在E47细胞中被激活，而沉默Nrf2会降低GSH的水平并增加ROS和脂质过氧化，导致E47细胞的活力下降。因此，在酒精性肝损伤中，参与乙醇代谢的CYP2E1水平升高可激活Nrf2，其蛋白质和mRNA水平增加，而发挥抗氧化作用。这表明在酒精性肝损伤中，乙醇代谢使CYP2E1升高，激活Nrf2，Nrf2通过降低ROS和MDA、增加GSH来发挥抗氧化作用，这种作用均发挥在氧化系统与抗氧化系统。由此可见，在酒精性肝损伤中不止一种机制能够激活Nrf2发挥抗氧化作用。

Nrf2相关通路抗氧化机制不但与酒精代谢引起的肝损伤相关，药物也可将Nrf2相关通路作为调节氧化应激的潜在靶点。Yu等[37]通过分离小鼠原代肝细胞培养后，利用大豆苷元预干预，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导氧化应激，发现100 μmol/L大豆苷元上调Nrf2的表达使LPS诱导的ROS产生减少，SOD活性增加，提示大豆苷元可通过调控Nrf2通路来抑制炎症和氧化应激。类似地，Lv等[38]发现daphnetin在小鼠和HepG2细胞中也可能通过上调Nrf2/Trx-1来减轻氧化应激。Hu等[39]用LPS和D-氨基半乳糖诱导小鼠发生急性肝损伤，并用油酸乙醇酰胺(oleoylethanolamide，OEA)预处理和治疗。结果发现OEA预处理降低了肝脏MDA水平，通过上调Nrf2和HO-1增加SOD和GSH-Px水平，上述研究表明，OEA可通过Nrf2相关通路发挥抗炎和抗氧化应激作用，减轻急性肝损伤。Xu等[33]研究发现大豆肽可刺激H2O2诱导的HepG2细胞中Nrf2，激活的Nrf2可上调SOD、CAT和GSH-Px的水平，抑制ROS和MDA生成。上述研究表明，上调Nrf2可在氧化应激和抗氧化应激2个方面抗氧化和保护细胞，减轻肝损伤，可能发挥关键作用。

4.2 氧化应激与NF-κB NF-κB是炎性反应和免疫反应的重要调节剂，其家族包括5种亚型：NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)、c-Rel、Rel A(p65)和Rel B，其中Rel A(p65)即NF-κB p65是最重要的转录因子[40]。研究[34]表明，NF-κB可以单独或通过其他通路影响氧化应激，上述的Nrf2的抑制或失活将激活NF-κB的转录。Long等[41]使用APAP造成小鼠急性肝损伤后，并用蚕蛹油(Silkworm pupa oil)干预，发现蚕蛹油可以减少肝组织中NF-κB p65的表达，即可以抑制NF-κB p65信号通路，减低MDA水平，升高SOD和GSH-Px活性，从而减轻急性肝损伤，因此抑制NF-κB信号通路可以减轻APAP诱导的急性肝损伤。此外，Wang等[42]使用花姜酮(Zerumbone，ZER)干预CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型，发现ZER预处理降低了Toll受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、NF-κB p-p65和环氧化酶(cyclooxygenase，COX-2)的蛋白水平，并且恢复了SOD和GSH-Px的活性，降低了MDA的产生，且均呈剂量依赖性；并在LPS诱导的炎性细胞模型中进一步证明ZER可能通过抑制TLR4/NF-κB/COX-2途径来对抗氧化应激和炎症，从而达到保肝作用，这表明在体内和体外ZER均可通过抑制NF-κB相关通路来发挥抗氧化作用。Li等[43]使用脂多糖/D-氨基半乳糖诱导急性肝衰竭小鼠模型，发现4-辛基衣康酸(4-Octyl Itaconate，4-OI)可以减轻实验组小鼠肝损伤，降低血清ALT和AST水平，并且4-OI可激活Nrf2，抑制NF-κB p65的激活，从而减轻ROS相关的肝细胞凋亡。除药物性肝损伤外，NF-κB信号转导机制也参与酒精性肝损伤中的氧化应激反应。Zhang等[44]也发现黑牛肝菌(Boletus aereus)可保护酒精诱导的小鼠急性肝损伤，且此种保护机制与氧化应激介导的NF-κB信号转导相关。但不同的是，在Boletus aereus中检测到了其他抗氧化剂，如维生素、总多酚和总甾醇，可以调节体内的氧化应激，减少ROS的产生，并且抑制NF-κB信号通路的激活。由此可见，NF-κB信号转导通路可以促进炎症，且部分可能受Nrf2的调控影响氧化应激。

除了上述较为常见的分子通路外，氧化应激也有其他相关分子或通路(图3)。Liu等[45]通过外源性腹腔注射百草枯建立大鼠急性肝损伤模型，产生氧化应激，并且实验组在注射百草枯前1 h注射不同剂量的NaHS，结果发现H2S显著抑制ROS的产生和MDA含量的升高，同时增加GSH/GSSG比值以及SOD、GSH-Px等抗氧化酶的水平。这表明药物并不完全是激活Nrf2和抑制NF-κB来达到减轻氧化应激作用的，但是基于目前的研究，激活Nrf2和抑制NF-κB在抗氧化中发挥重要作用。因此，在抗氧化过程中，如何调节信号通路从而减轻氧化应激所致肝损伤有待深入研究。

图3 氧化应激主要通路简要示意图

5 小结与展望

近年来，关于氧化应激与急性肝损伤乃至肝病的发生发展机制取得了一些进展，尤其是Nrf2与NF-κB等因子对氧化应激的调控，从分子生物学水平推动了氧化应激与肝病发病机制的研究。但上述研究大部分尚处于动物实验或细胞验证阶段，对大规模人群的长期研究仍任重道远。

在研究肝脏疾病发病机制时，可从以下方面进行：(1)探讨氧化应激对病毒、酒精、药物等不同病因所诱导的异同机制；(2)探讨ROS产生增多对肝细胞、肝星状细胞、Kupffer细胞等数量、活力、功能的影响及其机制；(3)探讨ROS诱导的肝脏组织病理且与其他器官病理的异同；(4) 探讨氧化应激相关信号传导的变化且与其他器官受损时信号变化的异同。

氧化应激的生物标志物可作为诊断工具或治疗靶点，在未来研究以氧化应激为治疗靶点时可从以下方面进行: (1)探索在急性肝损伤中线粒体介导ROS的分子通路，研究能否通过阻止主要通路而抑制或弱化氧化应激的发生；(2)探索急性肝损伤中抗氧化体系减弱(如抗氧化酶表达受抑或酶活性减弱)的分子机制，能否通过增强抗氧化体系阻止或减轻氧化应激；(3)探索氧化应激对肝炎-肝硬化-肝癌三部曲的影响程度及机制。加深对氧化应激的认识，合理使用抗氧化剂，加上适度的有氧运动，可以减轻或逆转氧化应激引起的损伤，与氧化应激相关的信号通路或许可以成为肝脏疾病诊断和治疗的潜在靶点。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：廖月负责查阅文献及撰写文章；何毅怀、罗亚文参与修改文章的关键内容。