张成玲 谭艺 魏庆骅 戴雪杉 陈怡

摘要 目的：采用網络药理学方法探究桃核承气汤治疗子宫内膜异位症的成分、作用靶点和作用机制。方法：通过数据库收集桃核承气汤的活性成分，获得其靶点，结合子宫内膜异位症的靶点，构建“桃核承气汤成分靶点-子宫内膜异位症靶点”网络，分析获得共有靶点。通过与FDA药物靶点比较，分析共同靶点可能治疗的疾病，构建“关键靶点-疾病”网络。接着，将共同靶点进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路分析。最后将活性成分与关键靶点进行分子对接。结果：收集得到桃核承气汤114个活性成分及其236个靶点，401个子宫内膜异位症靶点，从中筛选出48个共同靶点。共同靶点与1 215个FDA药物靶点之间有29个关键靶点，与56种疾病相关联，其中包括子宫内膜异位症。GO分析表明，共同靶点与细胞外基质、细胞膜及DNA结合紧密相关，并涉及RNA酶和转录过程的正调节、ERK1/2通路正调控等多个生物过程。KEGG通路分析显示这些靶点参与类风湿性关节炎、TNF、雌激素、VEGF等63条信号通路调控。分子对接发现，8个桃核承气汤活性成分与5个共同靶点对接成功，其中甘草异黄酮和槲皮素与5个靶点都有较好的结合活性。结论：初步揭示了桃核承气汤治疗子宫内膜异位症的作用机制，有利于其深入地研究和开发。

关键词 桃核承气汤;子宫内膜异位症;网络药理学;分子对接;作用机制;药效物质基础

Deciphering Mechanisms of Taohe Chengqi Decoction in the Treatment of Endometriosis Based on Network Pharmacology

ZHANG Chengling，TAN Yi，WEI Qinghua，DAI Xueshan，CHEN Yi

（College of Pharmaceutical Sciences & Chinese Medicine，Southwest University; Chongqing Key Laboratory of New Drug Screening from Traditional Chinese Medicine; Pharmacology of Chinese Materia Medica-the Key Discipline Constructed by the National Administration of Traditional Chinese Medicine; National Demonstration Center for Experimental Pharmacy Education（Southwest University），Chongqing 400715，China）

Abstract Objective：To explore the ingredients，targets and mechanism of Taohe Chengqi Decoction（TCD） on endometriosis by network pharmacology.Methods：The active ingredients of Taohe Chengqi Decoction were collected through the database，its targets were obtained，and we combined with the targets of endometriosis to construct a network of “Taohe Chengqi Decoction Components Targets-Endometriosis Targets”，and analyzed them to obtain a common target.By comparing with FDA drug targets，we analyzed the diseases that a common target may treat，and constructed a “key target-disease” network.Then，the common target was analyzed for GO and KEGG pathways.Finally，the active ingredients were molecularly docked with key targets.Results：A total of 114 TCD active ingredients，236 targets and 401 endometriosis targets were collected.From those，48 common targets were screened.There were 29 key targets between the common targets and 1215 FDA drug targets，which were associated with 56 diseases，including endometriosis.In GO enrichment analysis，common targets were closely related to extracellular matrix，cell membrane and DNA binding.It involved in many biological processes，for example the positive regulation of RNA polymerase，transcription process，and the positive regulation of ERK1/2 pathway.KEGG pathway analysis showed that common targets were involved in 63 pathways，including rheumatoid arthritis，TNF，estrogen and VEGF，etc.It was found in molecular docking that there were 8 active ingredients of TCD were successfully binding with 5 common targets，especially licoisoflavone and quercetin.Conclusion：This study preliminarily reveals the mechanism of TCD on endometriosis，which is beneficial for its further research and development.

Keywords Taohe Chengqi Decoction; Endometriosis; Network pharmacology; Molecular docking; Mechanism; Material basis of pharmacodynamics

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.012

桃核承气汤是经典的活血化瘀方，出自《伤寒论》，由桃仁、大黄、桂枝、甘草和芒硝五味中药组成，临床上多用于治疗妇科疾病[1]。近年来研究发现，桃核承气汤对糖尿病、中风、慢性肾功能衰竭、肝性脑病、胆囊炎、子宫内膜异位症、急性盆腔炎、肝病等多种疾病有治疗作用[2-4]。尽管如此，但桃核承气汤治疗子宫内膜异位症的作用机制并不清楚。

目前，网络药理学已广泛应用于中药复方的研究，这对于揭示中药多成分、多靶点和多通路之间的潜在联系具有重要价值[5-6]。但是网络药理学数据库预测的靶点是否为有效的治疗靶点仍是一个有待于解释的问题。现采用网络药理学方法，研究桃核承气汤中潜在的活性成分、靶点以及分子作用机制，并通过分子对接进行验证，为深入研究桃核承气汤治疗子宫内膜异位症的药效物质基础和作用机制提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 桃核承气汤成分、成分对应靶点、子宫内膜异位症靶点及FDA药物靶点收集

以“桃仁”“大黄”“桂枝”“甘草”和“芒硝”为关键词，在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中进行检索，挖掘桃核承气汤活性成分，并设定口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18以及小肠上皮细胞渗透率（Caco-2）≥-0.40进行筛选。利用TCMSP、相似性集成方法数据库（SEA，http：//sea.bkslab.org/）和中药分子机制生物信息学分析工具（Batman-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/Batman-Tcm/）对桃核承气汤活性成分的潜在靶点进行预测。运用高通量基因表达数据库（GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），结合基因疾病数据库协会（DisGeNET，http：//www.disgenet.org/）和人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https：//omim.org/），获得子宫内膜异位症相关的靶点。经桃核承气汤靶点与子宫内膜异位症靶点比较获得共同靶点。运用药物数据库（DrugBank database，https：//www.drugbank.ca/drugs）和治疗靶点数据库（TTD，https：//db.idrblab.org/ttd/）收集FDA批准药物靶点。然后将共同靶点再与FDA药物靶点比对，筛选出关键靶点[7]。

1.2 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的构建及分析

将共同靶点和FDA药物靶点中筛选出的关键靶点，导入到数据库TTD、TCMSP和（SymMap，http：//www.symmap.org），预测其可能治疗的疾病，并根据医学主题标题（MeSH，http：//www.nlm.nih.gov/mesh/），将疾病分为不同的类别。用Cytoscape 3.8.0软件构建“桃核承气汤-活性成分”网络、“桃核承气汤靶点-子宫内膜异位症靶点”网络以及“关键靶点-疾病”的网络。

1.3 基因功能与KEGG通路富集分析

将筛选后的共同靶点上传到人类基因组注释数据库（DAVID ver6.8，https：//david.ncifcrf.gov/），进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集通路分析，设定阈值P<0.05，分别列出GO分析中排名前5和KEGG通路分析中排名前20的结果[8]。

1.4 分子对接

关键靶点的PDB-ID由RCSB-PDB数据库获得（https：//www.rcsb.org/），桃核承气汤成分的3D分子结构文件从有机小分子生物活性数据库（Pubchem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获取，在chem3D中转化成mol2格式。将获得的PDB-ID及分子结构分别导入SYBYL-X2.1.1软件进行分子对接验证。对接打分值（Docking Score）为试验解离/抑制常数值的负对数（a Negative Logarithm of Experimental Dissociation/inhibition Constant Value，pKd/pKi），评分标准为：Docking Score>4.25，表明分子与对接靶点具有一定的结合活性;Docking Score>5.0，表明分子与对接靶点的结合活性较好;Ddocking Score>7.0，则表明分子与靶点的结合模型具有强烈的稳定性及活性[9-10]。

2 结果

2.1 “桃核承气汤-活性成分”网络的构建

筛选得到114个桃核承气汤活性成分，其中桃仁13个，大黄9个，桂枝7个，甘草88个，芒硝0个，构建“桃核承气汤-活性成分”网络，由118个节点，117个边线组成。见图1。谷甾醇和β-谷甾醇是共同的活性成分。其中，桂枝和甘草均含有谷甾醇。同时，β-谷甾醇不仅属于桃仁，也属于大黄和桂枝。这说明谷甾醇和β-谷甾醇可能是协同治疗的物质基础。

2.2 “桃核承气汤靶点-子宫内膜异位症靶点”网络的建立

檢索TCMSP、SEA和Batman-TCM数据库，并去除重复靶点后，得到的107个活性成分对应236个靶点，其中桃仁51个靶点，大黄66个靶点，桂枝49个靶点，甘草226个靶点，其余7个成分无靶点。在疾病数据库中检索得到401个子宫内膜异位症靶点。“桃核承气汤靶点-子宫内膜异位症靶点”网络由591个节点和637条边线组成。从中筛选出48个共同靶点，其中桃仁8个靶点、大黄11个靶点、桂枝9个靶点、甘草44个靶点。见图2。

2.3 “关键靶点-疾病”网络的构建

从TTD和DrugBank数据库中，获得1 215个FDA批准的药物靶点。将上述的48个共同靶点与FDA药物靶点比对，筛选出了29个关键靶点。在DrugBank和TTD数据库中，发现29个关键靶点与10个不同的类型、56种疾病相关，构建的“关键靶点-疾病”网络图，由95个节点和228条边线组成。见图3。关键靶点相关的疾病，大部分属于肿瘤（26.79%）、神经系统疾病（17.86%）和心血管疾病（19.64%）。其中，3.57%的关键靶点分布在子宫内膜异位症和雌激素缺乏2种妇科疾病中，而与妇科疾病的相关靶点有PTGS2、PPARG、PGR、ESR1、ESR2，这说明桃核承气汤治疗子宫内膜异位症和雌激素缺乏，可能依赖于这些靶点。

2.4 GO和KEGG通路富集分析

GO分析结果表明，48个共同靶点分别与84个生物过程（BP）、6个细胞组分（CC）和17个分子功能（MF）相关。排名前5的GO富集分析的生物信息见图4。其中，生物过程包括RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、序列特异性DNA结合转录因子活性的正向调控、转录DNA模板、脂多糖介导的信号通路和ERK1/2级联的正调控。涉及的细胞组分有，细胞外空隙、胞液、细胞外基质、线粒体外膜和质膜的外侧面。而分子功能主要是锌离子结合、序列特异性DNA结合、细胞因子活性、转录因子活性，序列特异性DNA结合和同一蛋白结合。

KEGG通路富集发现，48个共同靶点与63条信号通路相关，包括了肿瘤、类风湿性关节炎、乙型肝炎、疟疾、T细胞信号通路、血管生成、和激素调节等。排名前20的通路信息。见图5。雌激素信号通路不仅是共同靶点分布较多的通路之一，也是子宫内膜异位症重要的发病机制之一。

2.5 桃核承气汤中部分活性成分具有潜在的与共同靶点的结合活性

将桃核承气汤的9种活性成分，与子宫内膜异位症和雌激素缺乏相关的5个共同靶点进行分子对接。9种活性成分包括甘草异黄酮，甘草利酮，表儿茶素，槲皮素，芦荟大黄素，β-谷甾醇，菜油甾醇，氧麦角甾醇和常春藤皂苷元。5个共同靶点包括PTGS2、PPARG、PGR、ESR1和ESR2。除常春藤皂苷元外，其他8种活性成分均与PTGS2和PPARG具有结合活性。在9种有效成分中，只有甘草异黄酮和槲皮素与5个共同靶点均有的结合活性。甘草利酮和甘草异黄酮与PTGS2和PPARG具有很强的结合活性，同时表儿茶素与PPARG也具有很强的结合活性（Docking Score>7.0）。但是常春藤皂苷元与5个靶点没有结合活性。见表1。槲皮素、表儿茶素、菜油甾醇、β-谷甾醇、芦荟大黄素、氧麦角甾醇、甘草利酮和甘草异黄酮8种活性成分，可能是桃核承气汤潜在的药效物质基础。

3 讨论

中医认为，桃核承气汤是治疗血瘀证的经典妇科名方，由桃仁、大黄、桂枝、甘草和芒硝5味中药组成。目前对桃核承气汤的活性成分、潜在靶点和作用机制仍不清楚。网络药理学因其对多组分、多靶点、生物过程和通路的系统分析而被认为是解释中医药的理想方案。随着网络药理学和分子对接的方法应用于桃核承气汤的研究，将有利于进一步揭示其作用机制。

槲皮素是一种天然的生物类黄酮，具有多种药理作用。本研究发现槲皮素是桃核承气汤中甘草的有效成分之一，经过关键靶点分析，发现桃核承气汤可能作用于子宫内膜异位症和雌激素缺乏的药物靶点。迄今为止，槲皮素对这2种妇科疾病均有药理作用。首先，槲皮素可抑制子宫内膜异位症细胞增殖、抑制细胞周期、诱导细胞凋亡[11]。除此之外，槲皮素降低ESR1、ESR2和PGR水平，可防止大鼠子宫内膜异位症发生[12]。最后，虽然没有确凿的证据表明槲皮素对雌激素缺乏有作用，但槲皮素可以激活ERs刺激成骨细胞活动[13]。分子对接中，槲皮素与PGR和ESR1结合，特别是与ESR2结合，在5个靶点对接中得分是最高的，但槲皮素与ESR2的结合位点有待进一步研究。

在许多组织观察到，过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome Proliferator-activated Receptors，PPARs）包括PPARα，PPAR β/δ，PPARγ，对细胞增殖、脂肪代謝、胰岛素修饰和分化有一定的作用[14-15]。近年来研究表明，PPARG在子宫内膜异位症中表达上调[16-17]。在雌激素缺乏大鼠模型中，卵巢切除可显著增加PPARγ基因的表达，同时ESR1基因表达降低[18-19]。表儿茶素是其中的一种活性成分，通过抑制PPARγ的表达，进而抑制脂肪细胞分化来预防肥胖[20]。表儿茶素还下调人体免疫细胞中的PPAR信号[21]。然而，表儿茶素对年老小鼠PPARγ的作用恰恰相反，显著提高PPARγ mRNA水平，降低PPARγ蛋白水平，以此提高生存率[22]。本研究中，表儿茶素与6个靶点的分子对接验证中对接评分最高的靶点即为PPARγ。以上结果表明，表儿茶素在不同疾病中对PPARγ的作用可能有所不同。

综上所述，通过网络药理学和分子对接方法发现，桃核承气汤的107种有效成分与236个靶点相关。将筛选出的桃核承气汤和子宫内膜异位症的48个共同靶点，与FDA批准的药理活性药物靶点对比，得到的29个关键靶点与56种疾病相关联，其中就包括了子宫内膜异位症和雌激素缺乏2种妇科疾病。分子对接结果显示桃核承气汤的8种活性成分与5个共同靶点（PTGS2、PPARG、PGR、ESR1、ESR2）具有结合活性。这些结果为桃核承气汤的评价和临床应用提供了网络药理依据，后续研究则对桃核承气汤治疗子宫内膜异位症的潜在药理作用机制进行进一步的实验验证。

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（2020-12-05收稿 责任编辑：魏庆双，徐颖）