白峰岩 汪海霞 柳 旎 朱彩华 忤秋月

急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)是儿童常见的血液系统恶性肿瘤，占儿童白血病的50%以上[1]。随着医学的进步，我国ALL患儿5年生存率可达80%左右，但有约15%的患儿出现复发，常导致预后不良的发生[2]。ALL的主要治疗手段以联合化疗为主，但易发生骨髓抑制、脏器损伤、黏膜炎症等不良反应[3]。因此，有必要寻找与ALL相关的分子指标对患儿预后进行监测以减少患儿发生预后不良的情况。微小RNA(mirco-RNA，miRNA)是一种游离短链非编码RNA，研究表明miRNA参与调控多种生命活动，某些miRNA能够影响肿瘤疾病的发生发展[4]。研究表明miR155通过泛素化途径促进肿瘤细胞的增殖和转移[5]，而miR181家族通过参与调控肿瘤细胞自噬和促进肿瘤耐药的发生在肿瘤生长中发挥重要作用[6]。研究表明miR155、miR181在许多肿瘤疾病中表达升高[7]，但与ALL的相关研究较少。本研究通过检测ALL患儿外周血中单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)miR-155及miR181的表达水平，分析其与临床资料的相关性，旨在为ALL患儿预后的判断提供相关依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年7月至2017年7月在本院血液科就诊的51例ALL患儿作为研究组，其中男性33例、女性18例，年龄1～12(6.12±2.11)岁。ALL诊断及分型参照中华医学会儿科分会ALL诊疗方案(第四次修订)标准[8]，经过分子生物学、细胞遗传学及骨髓细胞形态学确诊，排除合并其他疾病及不能耐受化疗的患儿。收集ALL患儿年龄、性别等临床资料和相关检查指标。另选取同期体检正常儿童51例作为对照组，男性27例、女性24例，年龄1～11(6.33±1.56)岁。

1.2 治疗及随访

所有患儿均依据中华医学会儿科分会ALL诊疗方案(第四次修订)标准[8]采用VDLP(长春新碱+柔红霉素+门冬酰胺+强的松)等方案依次进行化疗，化疗期间严密监控防止出现不良反应。疗程结束后依据中华医学会儿科分会ALL诊疗方案(第四次修订)标准[8]对化疗效果进行评价，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、未缓解(NR)和复发。采用门诊随访、电话随访等方式，每间隔3个月随访1次，末次随访时间2020年7月。

1.3 外周血中PBMC的分离及RNA的提取

研究组患儿于化疗前后采集外周血，对照组儿童于体检时采集外周血。无菌采集外周血5 ml于肝素抗凝管中，离心去除血浆，加入等体积生理盐水稀释。向淋巴细胞分离液(Ficoll，瑞典GE Healthcare公司)中缓慢滴加经稀释的外周血，780 g×30 min离心。结束后吸取中层白膜层细胞即为PBMC。生理盐水洗涤细胞，加入1 ml Trizol(上海酶联生物公司)，保存于-80 ℃中。检测时取出EP管置于冰面解冻，提取细胞总RNA，使用NanoDrop 2000测量，OD260/OD280>1.8说明所提取RNA质量较高，将RNA逆转录为cDNA模板进行检测。

1.4 RT-PCR技术检测PBMC中miR-155、miR181水平

反应体系20 μL，其中cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.8 μL、q-PCR Mix反应液10.4 μL。反应条件为95 ℃预变性5 min、95 ℃ 30 s、54 ℃ 60 s、70 ℃ 60 s，共进行40个循环。以U6为内参采用2-ΔΔCt法测定PBMC中miR-155及miR181的相对表达量。所有引物均委托上海生工生物公司合成。miR-155引物：F：5’-GCCGCTTAATGCTAATCGT-G-3’，R：5’-CAGTGCTGGGTCCGACTGA-3’；miR-181引物：F：5’-GCCGAGAACATTC-ATTGCTGT-3’，R：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’。

1.5 统计分析

2 结果

2.1 2组PBMC中miR-155、miR-181相对表达水平比较

化疗前研究组患儿外周血来源PBMC中miR-155、miR-181表达水平明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.001)，见表1。

表1 2组儿童外周血PBMC中miR-155、miR-181相对表达水平比较

2.2 ALL患儿化疗前miR-155、miR-181水平与临床资料的关系

结果显示外周血来源PBMC中miR-155、miR-181相对表达量与患儿年龄、性别及有无肝脾肿大无关(P>0.05)，但与患儿白细胞计数、LDH及CA-125水平相关，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 ALL患儿化疗前PBMC中miR-155、miR-181相对表达量与临床资料的关系

2.3 ALL患儿PBMC中miR-155、miR-181水平与化疗效果的关系

51例ALL患儿化疗效果：CR 27例、PR 7例、NR 9例及复发8例。化疗后CR组、PR组、NR组及复发组的ALL患儿PBMC中miR-155、miR-181相对表达水平具有明显差异(P<0.001)，其中CR、PR组患儿PBMC中miR-155、miR-181相对表达水平明显低于复发组患儿，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 化疗后不同效果组患儿PBMC中miR-155、miR-181水平比较

2.4 ALL患儿PBMC中miR-155、miR-181水平与预后的关系

本研究截止到最后一次随访，51例ALL患儿存活36例，死亡11例，失访4例，存活率为70.59%。所有死亡患儿均死于ALL复发及并发症，无其他原因导致的死亡病例。化疗前外周血PBMC中miR-155表达水平上升的患儿共27例、死亡6例、失访2例；表达水平未升高的患儿24例、死亡5例、失访2例。miR-181表达水平上升的患儿共29例、死亡7例、失访3例；表达水平未升高的患儿22例、死亡4例、失访1例。采用Kaplan-Meier法对患儿进行生存分析，结果显示外周血PBMC中miR-155、miR-181表达水平上升患儿的生存率明显低于表达水平正常者，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 PBMC中miR-155、miR-181表达水平与患儿预后的关系

3 讨论

miRNA是一种短链非编码RNA，通过多种途径调控机体生命活动。有研究表明miRNA水平与肿瘤疾病的发生发展相关，在肿瘤细胞增殖和凋亡过程中扮演重要角色[9]。一些miRNA可作为肿瘤疾病的标志物而被广泛研究，而miR-155在免疫调控、炎症反应和造血系统中发挥的作用被逐渐认知[10]。国内学者Cui等的研究表明miR-155表达受到原癌基因B细胞真核簇(B-cell-integration cluster，BIC)的影响[11]，miR-155表达水平升高常提示细胞增殖活性上升，凋亡减少。已有研究证明miR-155在乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌[12-14]等实体肿瘤中的表达水平常与肿瘤的发展及预后相关。相关动物实验表明转染miR-155后可诱发小鼠白血病的发生[15]，进一步证明了miR-155的促癌作用。miR-181是一种新发现的miRNA，近年来对其研究发现肿瘤患者miR-181常呈高表达。研究表明miR-181在胃癌患者血清中水平升高，且与患者肿瘤分期相关[16]；而在晚期肝细胞癌患者中miR-181表达常高于早期患者[17]。miR-181高表达与肿瘤的发生发展相关，但机制尚不明确。在本研究中ALL患儿外周血PBMC中miR-155及miR-181表达水平明显高于对照组，提示miR-155及miR-181与儿童ALL的发病密切相关，但机制仍需要进一步研究。

随着医学技术的进步，儿童ALL的治疗效果明显提高，5年生存率显著提高，但复发率仍较高。本研究发现经化疗后不同组患儿外周血PBMC中miR-155、miR-181具有明显差异，而复发组患儿miR-155、miR-181水平明显高于CR和PR组，提示外周血PBMC中miR-155、miR-181水平可在一定程度反映化疗效果，高表达者易复发。文献报道高表达miR-181的肝癌患者易发生化疗耐药，可能与miR-181参与调控肿瘤细胞自噬相关[18]，研究表明miR-181通过靶向STAT3/Bcl-2/Beclin 1通路影响细胞自噬水平诱导肿瘤化疗耐药的产生[19]。而miR-155被证实在宫颈癌中以调控炎症的方式提高细胞自噬水平，miR-155高表达还能够抑制PDK1/mTOR信号通路促进p62蛋白的表达以促进宫颈癌的发生发展[20]。miR-155、miR-181高表达导致患儿易复发的机制尚不明确，可能是改变外周血中PBMC自噬水平及相关通路的结果。

miR-155水平可作为多种肿瘤预后的评价指标，而miR-155高表达常被认为是预后不良的象征[21]。临床研究表明血清中miR-155高表达的乳腺癌患者生存率低于低表达患者[22]，本研究还发现外周血PBMC中miR-155、miR-181高表达的ALL患儿预后较差，与miR-155、miR-181正常表达患儿相比生存率明显下降，研究结果与报道相符。

综上所述，ALL患儿外周血PBMC中miR-155、miR-181水平明显升高，CR、PR组患儿PBMC中miR-155、miR-181水平低于复发组，miR-155、miR-181高表达患儿生存率较低。但本研究中样本量较少，随访时间较短，需要在后续研究中进行改进，而miR-155、miR-181与ALL发生发展的相关机制仍需进一步研究。