陈雪琴 张建龙 万祥辉 魏小勇

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是国内外最常见和预后最差的恶性肿瘤之一。国际癌症研究机构最新数据显示，2017年肝癌全球新发病例95万，位列第六；死亡病例82万，位列第四[1]。近年来，肝癌的诊治技术虽得到不断提升，但肝癌患者的预后仍然较差，5年生存率甚至低于10%[2]。研究表明，肝癌的预后与肿瘤大小、数量、细胞分化程度、血管侵犯及炎症程度显著相关[3]，但即便没有这些重要因素的影响，肝癌的死亡率仍不尽人意。因此，寻找新的预测标记物对改善肝癌患者预后具有十分重要的意义。

白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)家族是由IL-1A、IL-AB及IL-1RA组成的重要炎性细胞因子。研究表明，IL-1通过调节宿主免疫系统与恶性肿瘤细胞的相互作用模式，在肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤侵犯及转移中发挥着重要的作用[4-5]。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一类具有RNA沉默和转录后基因调节功能的短链非编码RNA分子，它通过结合目的mRNA的3'UTR区发挥调控功能[6]。以往的研究表明，位于3'UTR区的遗传多态通过破坏miRNA与mRNA的结合，从而调控基因的表达[7]。大量的流行病学研究显示，位于IL-1A基因3'UTR区的遗传变异位点rs3783553与宫颈癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌及肝癌的发病风险显著相关[8-9]。我们以往的研究也表明rs3783553与慢性乙肝病毒感染风险存在关联，但目前对它在肝癌预后中的作用研究较少。基于rs3783553在慢性乙肝病毒感染及肝癌中的重要作用，我们通过队列研究的方法对rs3783553与肝癌预后之间的关系进行探讨。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2011年9月至2014年5月期间，我们严格按照纳入和排除标准，选择了510例在江西省肿瘤医院确诊的原发性肝癌患者作为研究对象。纳入的研究对象均是首次确诊的HCC患者，无恶性肿瘤病史且未进行任何抗肿瘤治疗。研究对象的人口学资料由经培训的研究员调查获得，临床资料来源于医院电子病历，随访资料由专门的随访员进行调查记录。患者出院后每3个月进行一次随访。我们的研究在取得江西省肿瘤医院伦理委员会的批准下进行。在研究对象知情同意后，对每位患者抽取1ml外周血用于基因分型。

1.2 基因型分析

首先采用百泰克凝固血基因组DNA小量提取试剂盒经过一系列步骤提取血样中的DNA。利用低通量基因分型方法TaqMan对所有样本进行分型。引物探针合成后，按照说明配置PCR反应体系，并将其加至384孔板中，每一个384孔板均设置4个阴性对照。采用ABI公司的9700高速基因扩增仪进行PCR反应，严格控制PCR的反应条件，随机抽取6个孔的样本进行凝胶电泳实验以检测PCR的质量。在7900HT荧光定量PCR仪上进行基因分型，采用SDS2.4软件读取分型后的数据。

1.3 统计学分析

患者的死亡时间定义为首次治疗时间至死亡时间或最后一次随访时间。采用显性、隐性及加性三种遗传模型对遗传变异位点的作用进行分析。采用Kaplan-Meier法和log-rank检验用来估计和比较不同基因型的生存曲线，采用Cox比例风险回归校正年龄、性别、吸烟情况及TNM分期的混杂影响，计算遗传变异位点rs3783553的校正HR (hazard ratios，HR)值及95%可信区间(confidence internal，CI)。所有数据均采用SPSS20.0软件包进行分析，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 研究人群的基本情况与预后分析

本研究共纳入510例原发性肝癌患者，其人口学特征及临床资料如表1所示。研究对象的年龄中位数为52岁，男性患者占86.27%，吸烟患者占43.5%。本研究的中位随访时间为35.5个月，共有289例患者在随访期间因肝癌死亡，死亡率为56.7%。单因素比例风险回归分析显示：年龄(HR=1.32，95%CI=1.04～1.66)和肿瘤分期(HR=5.38，95%CI=4.18～6.94)与肝癌患者死亡风险存在显著相关性。

表1 研究人群的基本特征与预后分析(例，%)

2.2 基因分型结果及生存曲线分析

基因分型结果显示，在研究对象中存在缺失/缺失(Del/Del)、缺失/插入(Del/Ins)和插入/插入(Ins/Ins)三种基因型分布。510例研究对象中共有492例分型成功。不同基因型患者的生存情况如图1所示。Del/Del基因型HCC患者中位生存期为41.1个月，Del/Ins+Ins/Ins基因型HCC患者中位生存期为43.8个月。Log-rank检验比较两者的生存曲线显示，携带Del/Del基因型患者生存率与Del/Ins+Ins/Ins基因型患者的差别无统计学意义(P=0.994)。

图1 rs3783553不同基因型肝癌患者生存曲线

2.3 遗传变异位点rs3783553与肝癌死亡风险的关联性分析

遗传变异位点rs3783553在HCC人群中的分布及其与HCC死亡风险之间的关系分析如表2所示。在多因素Cox回归模型中经过对年龄、性别、吸烟情况及肿瘤分期进行校正后，尚未发现rs3783553不同基因型患者与肝癌死亡风险相关(显性模型：HR=0.92，95%CI=0.71～1.19；加性模型：HR=0.91，95%CI=0.76～1.11)。我们进一步对年龄、性别、吸烟及肿瘤分期情况进行分层分析，在显性模型中运用Cox回归模型对其他因素校正后，未发现rs3783553与肝癌死亡风险相关(表3)。

表2 rs3783553基因型频率分布及其与HCC死亡风险的关系

表3 显性模型中rs3783553与HCC死亡风险关联分层分析

3 讨论

MicroRNA-122是肝脏中最丰富的miRNA，约占所有miRNA种群的70%[10]。越来越多的证据表明microRNA-122在肝癌的发生发展中发挥着重要的作用，血清中microRNA-122的表达水平与肝癌的预后风险显著相关[11]。体外的研究表明，microRNA-122可作为肿瘤抑制基因调节原发性肝癌的转移[12]，肝癌组织中microRNA-122表达的缺失可增强癌细胞转移属性[13]。MiRNA的作用形式主要是通过与mRNA结合，调节mRNA水平与蛋白质的表达，而这种结合可被位于miRNA结合位点上的遗传多态所影响。本文主要探讨的是位于microRNA-122结合位点上的遗传多态在肝癌预后中的作用。

2009年，研究者们发现位于IL-1A 3'UTR区功能性多态位点rs3783553可通过改变与microRNA-122与miRNA378结合，影响IL-1A的表达。Gao等的研究表明rs3783553插入(TTCA)基因型可显著降低原发性肝癌的易感风险，TTCA基因型的缺失可增强IL-1A与microRNA-122与microRNA-378的结合，抑制IL-1A的表达，削弱了IL-1A在肿瘤发展中的免疫调节作用[14]。随后的研究也发现携带rs3783553插入(TTCA)等位基因的人群患鼻咽癌、胃癌、宫颈癌、卵巢癌及结直肠癌的风险显著降低[15]，且缺失等位基因型癌细胞的恶性程度显著升高。同时，在我们此前的研究中也显示遗传变异位点rs3783553与慢性乙肝病毒感染风险存在显著关联。因此，IL-1A rs3783553可能作为肝癌发生发展过程中的遗传标记物。基于此种假设，我们运用队列研究的方法对rs3783553与肝癌预后之间的关系进行了探讨，尚未发现rs3783553不同基因型患者与肝癌死亡风险相关。

我们的研究首次从miRNA的角度出发，探讨了位于microRNA-122靶基因IL-1A 3'UTR区功能性多态位点rs3783553与肝癌预后之间的关系。研究表明，虽然rs3783553与慢性乙肝病毒感染与肝癌的发生风险显著相关，但不是肝癌死亡风险的影响因素。本研究是一项前瞻性的队列研究，受样本量和随访时间的影响研究结果具有一定的局限性，仍需更大样本量的研究进行进一步论证。