潘静，杨人泽，钟斌

赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000

苦竹为禾本科植物，常年生长在山谷平原或向阳山坡，在我国南方各省市分布广泛，为竹资源中的优良品种，苦竹用途广泛［1］，竹笋、秆、皮、根等均已被开发利用［2-3］，但苦竹叶多被废弃。据《中药大词典》［4］中记载：苦竹叶有清热治血、解毒消肿，治吐血、下血、小便不利、喉痹、痈肿等功能。现代研究发现，苦竹叶含有大量的黄酮类化合物、多糖、生物碱、酚酸和挥发油、微量元素、氨基酸等成分［5-6］。多糖具有广泛药理活性：抗病毒、抗凝、抗炎、抗衰老、降血脂、降血糖、抗过敏、抗菌、免疫调节与抗肿瘤等［7］。随着相关研究的增多，越来越多具有生物活性的多糖资源不断被发现，但少见苦竹叶多糖抗肿瘤活性的报道，本研究提取精制苦竹叶多糖，并制成不同浓度样品进行抗肿瘤活性的研究，以期为苦竹叶资源的开发和利用提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

洁净工作台（SW-CJ-2FD，上海博迅）；CO2培养箱（Forma 311，美国Thermo）；倒置相差显微镜（CKX41，日本Olympus）；电子天平（SI-234，美国丹佛）；连续光谱多功能酶标仪（Varioskan Flash，美国 Thermo Fisher）。

1.2 药物与试剂

苦竹叶采自赣州崇义竹林园，经赣南医学院中药鉴定室鉴定；苦竹叶多糖（实验室自提）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma 公司）；RPMI-1640 培养基（Gibco公司）。

1.3 细胞株

子宫颈癌HeLa 细胞，肺癌A549 细胞，人胃癌SGC7901 细胞，由赣南医学院科研中心保藏提供。

2 方法

2.1 苦竹叶多糖制备

取苦竹叶粉末约200 g，用石油醚回流提取3 h，滤渣用无水乙醇回流1 h，脱色并除去小分子多糖，用40 倍原料质量的中性水在温度70 ℃条件下提取5 h，浸提2 次，然后按照 Sevage 法除去蛋白质。分液后取上层液体加入75%乙醇，摇匀后静置12 h 进行醇沉，得粗多糖12 g。初步纯化的苦竹叶多糖经 DEAE-32 离子柱层析，用0.1 mol/L NaCl 溶液进行洗脱，收集相应峰位组分，浓缩后，蒸馏水透析，冷冻干燥得到精制苦竹叶多糖8 g［8］。取苦竹叶多糖0.5 g，精密称定，用二甲基亚砜（DMSO）溶解于10 mL 容量瓶中，配制成质量浓度为50 g/L的苦竹叶多糖供试液，4 ℃冰箱保存，临用前用培养液稀释分别配制成不同浓度苦竹叶多糖50、100、200、400，600 μg/mL 以备实验用。

2.2 体外抗肿瘤活性测定

2.2.1 细胞株及培养条件 宫颈癌 HeLa 细胞、肺癌A549 细胞及人胃癌细胞株7901 常规培养于含10%胎牛血清RPMI-1640 培养基中，37 ℃，5% CO2培养箱中培养，3 d 换液1 次，取对数生长期细胞用于试验。

2.2.2 MTT法检测细胞生长抑制率 细胞以 5×104/孔接种于96 孔板，置37 ℃、5% CO2的培养箱中，次日细胞贴壁后弃去培养液，加入含不同浓度的（50、100、200、400、600 μg/mL）苦竹叶多糖培养液100 μL，每个质量浓度设6 孔，同时设空白对照组和以浓度为20 μg/mL的顺铂为阳性对照组各6 孔，然后置 37 ℃、5% CO2培养箱继续培养24、36、48 h；取出后加入5 g/L的MTT 溶液 20 μL，37 ℃避光继续培养4 h；每孔加二甲基亚砜（DMSO）150 μL，震荡10 min，混匀使甲瓒结晶充分溶解；置酶标仪490 nm 波长下检测各孔吸光度（OD），取6 个复孔的均值为最终结果；计算细胞抑制率，细胞抑制率=（空白对照组OD 值-多糖组OD 值）/空白对照组OD 值×100%［9］。采用lg C-抑制率回归分析法计算半数抑制浓度（IC50）。

2.3 统计学方法

应用SPSS 15.0 软件对数据进行统计学处理，抑制率值结果以表示，组间显著性检验采用单因素方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 苦竹叶多糖对子宫颈癌HeLa 细胞增殖的影响

苦竹叶多糖对子宫颈癌HeLa 细胞增殖的抑制率见表1，表1 是苦竹叶多糖干预48 h，浓度从50 μg/mL 增加到600 μg/mL 时，对子宫颈癌HeLa 细胞增殖的抑制率从5.10%升高到41.06%，干预72 h后,细胞增殖的抑制率从6.36%升高到45.52%，干预96 h 后，随着给药浓度的不断增加其抑制作用不断增强。苦竹叶多糖药物作用96 h的IC50为491 μg/mL，均低于72 h、48 h的IC50值，说明随着作用时间的延长，其对子宫颈癌HeLa 细胞抑制作用越明显。综上所述，在测定范围内，苦竹叶多糖对子宫颈癌HeLa 细胞具有抑制作用，呈现出一定的剂量、时间依赖性，不同浓度的给药组与空白对照组之间的差异有统计学意义（P＜0.05），不同时间不同浓度的给药组和阳性对照组相比较的结果如图 1 所示。

表1 不同浓度的苦竹叶多糖对子宫颈癌HeLa细胞增殖的影响（n=6）

图1 苦竹叶多糖和阳性对照组对子宫颈癌HeLa细胞增殖的比较

3.2 苦竹叶多糖对肺癌A549 细胞增殖的影响

苦竹叶多糖对肺癌A549 细胞增殖的抑制率见表2，表2 是当苦竹叶多糖浓度为50 μg/mL，培养时间从48 h 增加至96 h，其细胞抑制率为0，而当浓度提至100 μg/mL 时，培养时间从48 h 增加至96 h，其细胞抑制率从0.85%增加至8.49%.浓度提至200 μg/mL 时,其细胞抑制率从11.09%增加至19.18%.浓度增加至600 μg/mL 时,其细胞抑制率从29.32%增加至46.65%。苦竹叶多糖药物作用72 h的IC50为684 μg/mL，低于48 h的IC50值，但与96 h的IC50值相差不大，说明作用时间从48 h 延长至72 h，其对肿瘤细胞抑制作用明显增加，但到72 h 后，抑制作用增加不明显。综上所述，在浓度达到100 μg/mL以上时，随着培养时间的延长，苦竹叶多糖对肺癌A549 细胞具有抑制作用，呈现出一定的剂量、时间依赖性，不同浓度的给药组与空白对照组之间的差异有统计学意义（P＜0.05），不同时间不同浓度的给药组和阳性对照组相比较的结果如图2 所示。

表2 不同浓度的苦竹叶多糖对肺癌A549细胞增殖的影响（n=6）

图2 苦竹叶多糖和阳性对照组对肺癌A549细胞增殖的比较

3.3 苦竹叶多糖对人胃癌SGC7901 细胞增殖的影响

苦竹叶多糖对人胃癌SGC7901 细胞增殖的抑制率见表3，表3 是苦竹叶多糖干预48 h，浓度从50 μg/mL 增加到600 μg/mL 对人胃癌SGC7901 细胞增殖的抑制率从6.02%升高到46.63%，给苦竹叶多糖72 h 后,细胞增殖的抑制率从9.85%升高到51.81%，给苦竹叶多糖96 h 后,随着给药浓度的不断增加其抑制作用不断增强，苦竹叶多糖药物作用96 h的IC50为386 μg/mL，均低于72 h、48 h的IC50值，说明随着作用时间的延长，其对肿瘤细胞抑制作用越明显。综上所述，测定范围内，苦竹叶多糖对人胃癌SGC7901 细胞具有抑制作用，呈现出一定的剂量、时间依赖性。不同浓度的给药组与空白对照组之间的差异有统计学意义（P＜0.05），不同时间不同浓度的给药组和阳性对照组相比较的结果如图3 所示。

表3 不同浓度的苦竹叶多糖对人胃癌SGC7901细胞增殖的影响（n=6）

图3 苦竹叶多糖和阳性对照组对人胃癌SGC7901细胞增殖的比较

4 讨论

苦竹叶多糖是苦竹叶的重要成分，魏琦等［10］证明苦竹叶化学成分分离得到的木犀草素-6-C 洋地黄毒糖苷-4'-O-葡萄糖苷对子宫颈癌HeLa细胞、肝癌HepG2 细胞及结肠癌HT-29 细胞有体外增殖抑制作用，以此为基础，本实验提取精制苦竹叶多糖，以子宫颈癌HeLa 细胞、肺癌A549 细胞、人胃癌SGC7901 肿瘤细胞作为体外抗肿瘤实验模型，采用MTT 法观察苦竹叶多糖对3 种人恶性肿瘤细胞株的抑制作用，结果发现苦竹叶多糖在一定的浓度范围内，抑制作用较强且呈量效和时效关系，其中对人胃癌SGC7901 细胞增殖抑制作用最强，其次为子宫颈癌HeLa 细胞，最弱为肺癌A549 细胞。本实验为进一步将苦竹叶多糖开发成一个新的抗肿瘤药物提供了初步的依据，但其体内抗肿瘤及其机制仍有待进一步研究。