刘 涛， 姚兴璋， 何志军△， 宋 渊 ， 李 岩， 李金鹏，陈 文， 王海刚， 何元旭

（1甘肃省中医院，2甘肃中医药大学，甘肃兰州730050）

皮瓣是重大创伤和整形外科重要的修复手段，然而皮瓣坏死屡见不鲜，因此尽快建立血液循环是皮瓣成活的关键。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-Dll4/Notch 信号通路在血管再生中发挥着重要作用，近年被研究者重视。中医药在这方面的取得了一定的研究进展。前期研究发现，消肿止痛合剂能促进鼠尾再植后的血管修复，提高VEGF 表达水平［1］。临床研究发现消肿止痛合剂可显著降低软组织中肿瘤坏死因子α 和白细胞介素6的水平，促进皮瓣成活，降低转化生长因子β1和单核细胞趋化蛋白1 等炎症因子水平，阻止外伤后炎症介质的释放［2-3］。目前针对中医药通过VEGFDll4/Notch 信号通路调控皮瓣还鲜见报道。本研究采用大鼠随意皮瓣模型，利用消肿止痛合剂及联合VEGF-Dll4/Notch 信号通路阻断剂干预，观察皮瓣边缘血管数量，将进一步揭示VEGF-Dll4/Notch 信号通路在皮瓣血管再生中的作用机制。

材 料 和 方 法

1 材料

240 只健康SD 大鼠购自甘肃中医药大学动物实验中心，许可证号为SYXK（甘）2016-0012。VEGF 受体（VEGF receptor，VEGFR）抑制剂axitinib（AXI）和Notch 阻断剂MK-0752 均购自Selleck；免疫组织化学染色II 抗试剂盒（BOSTER）。倒置相差显微镜（OLYMPUS）。

2 实验方法

2.1 动物分组 将240 只大鼠随机分为6 组，空白（blank）组、假手术（sham）组、模型（model）组、消肿止痛合剂组（消肿组，detumescence 组）、消肿止痛合剂+AXI 组（detumescence+AXI 组）和消肿止痛合剂+MK-0752 组（detumescence+MK 组），每组 40 只。各组再按 4 个不同时点分为 5 d、10 d、15 d 和 20 d 亚组，每个亚组10只。

2.2 动物模型的建立 除空白组外所有SD 大鼠禁食6～8 h。术前行水合三氯乙醛（3 mg/kg）腹腔麻醉，麻醉生效后，行俯卧位固定。于背部形成2 cm×8 cm蒂部位于双侧髂棘连线上的随意皮瓣，皮瓣内包括背部肉膜层，解剖应在背部肌膜的浅面进行。结扎创面较活跃出血点，以确保所形成皮瓣为随意型皮瓣。皮瓣形成后用1 号缝合线间断原位缝合。待大鼠麻醉完全恢复后送回饲养笼、观察，单笼饲养。术后每日早上肌注青霉素12×104U，连用3 d。

2.3 药物处理 消肿止痛合剂由甘肃省中医院科研制剂中心制成，注册文号为甘卫普制准字（1997）-202-04，批号为20051122，规格为每瓶250 mL。消肿组每日灌胃服用10 mL/kg 消肿止痛合剂（含生药90 g/L）；消肿+AXI 组每日灌胃服用 10 mL/kg 消肿止痛合剂和 0.03 g/kg 的 VEGFR 抑制剂 AXI；消肿+MK 组每日灌胃服用10 mL/kg消肿止痛合剂和0.03 g/kg的Notch 阻断剂MK-0752；模型组、空白组和假手术组每日灌服相应体积的蒸馏水。分别服药5、10、15 和20 d 后分批麻醉并处死大鼠，剥离皮瓣组织多聚甲醛固定或-80℃保存，心脏取血离心分离血清。

2.4 HE 染色 皮瓣组织经多聚甲醛固定48 h 后，乙醇梯度脱水，二甲苯透明后进行石蜡包埋并切片。将脱水后的切片进行脱蜡至水，苏木素侵染5 min，流水冲洗5 min 后，盐酸分化5 s，伊红染液侵染5 min，流水冲洗5 min 后，树脂封片并进行拍照。利用Image-Pro Plus 6.0 软件计算皮瓣边缘新生毛细血管的数量（每个高倍镜视野下的阳性数目）、微血管密度（高倍镜视野单位面积下微血管数目）、微血管管径及血管成活面积。

2.5 ELISA 检测血清中VEGF 的含量 根据说明书运用酶标仪得出相关吸光度（A），再根据公式计算VEGF含量。

2.6 RT-qPCR 检测方法 将-80℃保存的皮瓣组织加入液氮研磨，呈粉末状后，加入1 mL Trizol 裂解液，将细胞置于冰板裂解5 min 后，将裂解液转移至离心管中-80℃保存。待所有样品收集完毕后，Trizol 提取RNA，逆转录合成cDNA。按照TaKaRa Prime Ex TaqTMⅡPCR 试剂盒操作说明进行。加样体积按照说明书进行，PCR 条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火，40 个循环，每个循环31 s，最后进行溶解阶段。所有结果经GAPDH 内参照校正后，ΔΔCt 法计算最终结果并采用 2-ΔΔCt表示，引物序列见表1。

表1 RT-qPCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3 统计学处理

采用SPSS 19.0 软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（mean±SD）表示。组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），方差齐者两组间的差异比较用SNK-q检验，方差不齐者两组间的差异比较用Dunnett 法。以P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

结 果

1 皮瓣毛细血管充盈时间

第5 天，模型组、消肿组、消肿+MK 组和消肿+AXI 组较空白组和假手术组毛细血管充盈时间均显著延长（P＜0.05）；第10 天，与模型组相比，消肿组毛细血管充盈时间显著缩短（P＜0.05），而与消肿组相比，消肿+AXI 组的毛细血管充盈时间显著延长（P＜0.05）；第15 和20 天所有组间的差异均无统计学显著性，见图1。

Figure 1.The results of capillary filling time.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs blank or sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.图1 毛细血管充盈时间结果

2 HE染色的观察结果

假手术组大鼠皮瓣组织细胞呈单层，排列有序、细胞核清晰；模型组大鼠皮瓣组织细胞排列紊乱，细胞核稀疏，可见明显水肿，大量白细胞浸润；消肿组和消肿+MK 组大鼠皮瓣水肿明显减轻，组织间隙炎症细胞浸润减少，见图2～5。

3 药物处理后微血管数量、大血管数量、微血管密度、微血管内径和微血管面积的变化

第5、10、15 和20 天时，与假手术组比较，模型组微血管数量、密度和面积均显著增加，其中第10 天增加最明显（P＜0.05）；与模型组比较，消肿组微血管数量、密度和面积增加，其中第10 天增加最明显（P＜0.05）；与消肿组相比，消肿+AXI 组的微血管数量、密度和面积显著减少（P＜0.05）；与消肿组相比，第5天和10 天消肿+MK 组的微血管数量和密度显著增加（P＜0.05）；第5、10、15 和20 天大血管数量和微血管内径在所有组间的差异无统计学显著性（P＞0.05），见图6～10。

Figure 2 HE staining results after 5 d of drug treatment（×100）.图2 药物处理5 d的HE染色结果

Figure 3.HE staining results after 10 d of drug treatment（×100）.图3 药物处理10 d的HE染色结果

4 血清中VEGF含量的检测结果

第5 天时，模型组VEGF 含量较假手术组显著增加（P＜0.05）；当加入消肿止痛合剂后，与模型组相比VEGF 含量显著增加（P＜0.05）；然而加入VEGFR 抑制剂后，消肿止痛合剂引起的VEGF 增加消失，与消肿组相比，消肿+AXI 组VEGF 含量显著降低（P＜0.05）；加入Notch 阻断剂后，消肿止痛合剂引起的VEGF增加趋势进一步增加，然而消肿组与消肿+MK组之间并无显著差异。第10、15 和20 天的结果与第5天类似。见图11。

5 皮瓣中 VEGFA、Notch 和 Dll4 mRNA 表达水平的检测结果

第 10 天 时 ，模 型 组 VEGFA、Notch 和 Dll4 的mRNA 表达量显著增加，与假手术组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；当利用消肿止痛合剂处理后，VEGFA、Notch 和 Dll4 的 mRNA 表达量进一步增加，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；然而，当加入VEGFR 抑制剂后，消肿止痛合剂引起的VEGFA、Notch和Dll4的mRNA 表达量增加的趋势被显著抑制，与消肿组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；当加入Notch 阻断剂后，消肿止痛合剂引起的VEGFA mRNA 表达量增加的趋势更加明显，而Notch 和Dll4 mRNA 表达量增加的趋势被有效抑制（P＜0.05），见图12。第 15 天时 VEGFA、Notch 和 Dll4 的 mRNA 表达量与第10天类似，见图13。

Figure 4.HE staining results after 15 d of drug treatment（×100）.图4 药物处理15 d 的HE染色结果

Figure 5.HE staining results after 20 d of drug treatment（×100）.图5 药物处理20 d的HE染色结果

讨 论

皮瓣技术是显微外科和矫形外科手术中重要的技术之一，用于覆盖肿瘤切除后大的创口、覆盖开放性伤口、治疗骨髓炎及整形［4-6］。但困扰医生的是发生术后皮瓣坏死，有研究报道皮瓣坏死发生率为10%～15%［7］。随意皮瓣受长宽比例限制，一般不超过2∶1，这就极大地限制了其临床应用。临床总结认为，血运障碍为皮瓣坏死最主要的原因。因此，寻找更好的药物和方法，改善皮瓣血运状况［8］，尽快促进皮瓣血管再生是提高皮瓣成活率的重中之重。

瘀血或血瘀证是皮瓣修复术后并发血管危象的主要病理基础，活血化瘀法应用于皮瓣修复术后体现了中医辨病辨证施治的原则［9］。“活血”即活其血脉，改善和促进循环生理功能；“化瘀”即祛其瘀滞，缓解血凝状态，解除已经发生的病理状态。消肿止痛合剂为甘肃省中医院院内制剂，由川芎、桃仁、红花、赤芍、生地、当归、三七、木香、青皮、泽兰等组成，具有活血化瘀、消肿止痛之功。组方中的川芍、红花、赤芍、三七等药物均有单体实验研究证明对血管有保护作用并具有抗凝作用；有研究证明川芎提取物川芎嗪可扩张血管，增加冠脉血流及脑血流，抑制血小板聚集，降低血小板活性，为一种钙拮抗剂［10-11］。

血管再生是指原有的血管内皮细胞增殖、游走，形成新的血管网，并在原来存在的血管结构上长出新血管的生物学过程。VEGF 是目前发现最强的促血管再生的细胞因子，具有促血管内皮细胞增殖和迁移、促血管生成、延长血管内皮细胞寿命、提高血管通透性等生物学作用［12-13］。VEGF-Dll4/Notch 信号通路对血管再生调节的具体机制为：VEGFA 通过与VEGFR2 结合，刺激并诱导内皮顶端细胞表达Dll4，Dll4 与邻近柄细胞内的Notch 信号结合，通过下调VEGFR2 和VEGFR1 的表达水平，抑制顶端细胞表型，促进柄细胞特化，使二者之间保持在一个合适的比例，以确保血管出芽的精确性［14］。由此可见，VEGF 是 Dll4 的正向调节因素，而 Dll4 是 VEGF 信号的负向调节因素［15］。VEGF-Dll4/Notch 信号通路在肿瘤血管再生及抗肿瘤药物治疗方面的研究较多，但是在皮瓣血管再生方面却未见报道。

Figure 6.Changes in the number of microvessels.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.图6 微血管数量的变化

Figure 7.Changes in the number of large blood vessels.Mean±SD. n=6.图7 大血管数量的变化

Figure 8.Changes of microvascular density.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.图8 微血管密度的变化

Figure 9.Changes of microvascular diameter.Mean±SD. n=6.图9 微血管的内径的变化

Figure 10.Changes of microvascular area.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.图10 微血管的面积的变化

Figure 11.Determination of VEGF in rat serum.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.图11 大鼠血清中VEGF含量的检测结果

Figure 12.The mRNA expression of VEGFA，Notch and Dll4 in flap tissues after 10 d of drug treatment.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.图12 药物处理10 d后皮瓣组织中VEGFA、Notch和Dll4的mRNA表达检测结果

Figure 13.The mRNA expression of VEGFA，Notch and Dll4 in flap tissues after 15 d of drug treatment.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.图13 药物处理15 d后皮瓣组织中VEGFA、Notch和Dll4的mRNA表达检测结果

本研究着重研究消肿止痛合剂对VEGF-Dll4/Notch 信号激活与血管新生的作用。皮瓣由于缺血缺氧的发生会导致血管内皮细胞的凋亡，造成不可逆的损伤，所以临床治疗中需要促进血管的新生，保护血管内皮细胞完整。本研究发现，消肿止痛合剂可显著提高皮瓣成活率，HE染色显示该药可增加微血管数量、密度和面积，减轻炎症反应，增强VEGF的表达。由于VEGF 是促进血管形成的起始关键细胞因子，可激活Notch 和Dll4 信号，这样的作用无疑是血管形成的关键。VEGFR 抑制剂可抑制VEGFA、Notch 和 Dll4 的 mRNA 表达增加，Notch 信号阻断剂引起对 Notch 和 Dll4 mRNA 的抑制，而 VEGFA 的mRNA 表达继续增加。抑制Dll4/Notch 信号转导可通过促进新生血管和血管生成，提高皮瓣成活率。

综上所述，消肿止痛合剂可以通过调控VEGFDll4/Notch 信号，促进大鼠皮瓣微血管数量、密度和面积增加，减轻皮瓣水肿，减少炎症细胞浸润，进而促进皮瓣的成活。本研究为消肿止痛合剂在皮瓣缺血缺氧治疗方面的应用提供了初步的研究基础。