王昌禄，刘 彤，李王强，杨明冠，3，路来风，李贞景，郭庆彬

(1.天津科技大学 省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457；2.天津科技大学 食品科学与工程学院，天津 300457；3.齐鲁工业大学 食品科学与工程学院，山东 济南 250353)

黄曲霉(Aspergillusflavus)是农作物及其产品的主要污染微生物之一，广泛存在于花生、玉米、马铃薯、棉花中。黄曲霉毒素(aflatoxins，AFT)是黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的代谢产物和真菌毒素，其种类有黄曲霉毒素B1、B2、B2a、M1、M2、寄生曲霉醇B3、BM1、GM1、GM2、P1、Q1等[1]。在相对湿度和温度较高的热带和亚热带国家和地区，黄曲霉及毒素极易对食品和动物饲料造成污染[2]。在田间、储藏期或运输过程中黄曲霉毒素污染均可能发生，一旦农产品和饲料受到污染，人类和动物的健康将受到重大威胁，农作物将遭受严重损失。因此，预防黄曲霉毒素的产生和真菌感染是解决食品安全问题的有效策略。同时，人类还应提高食品安全意识，避免食用受到黄曲霉及毒素污染的食品，企业也应严格按照我国颁布的相关法律、法规来生产、销售相关产品。

黄曲霉毒素的产生受相关基因的影响，防止黄曲霉毒素的合成就要抑制黄曲霉毒素基因簇中相关基因的转录。常见的黄曲霉毒素产生相关基因有aflR、aflS、flbA、hexB、dmtA和pks，其中，aflR基因可编码一个转录因子，该转录因子正向调控结构基因的表达[3-4]。FlbA是控制fadA介导的信号转导基因，fadA编码一个heterotrimeric G蛋白的α亚基，可以传递促进生长、抑制分生孢子和合成黄曲霉素的信号[5]。另外，黄曲霉毒素生物合成途径中起重要作用的基因还有estA、norB、ordB、accC、norM[6]。在研究中，为了更好地了解不同物质对黄曲霉毒素产生的影响，可利用qRT-PCR对黄曲霉毒素相关基因表达进行分析，还可以改变染色质修饰基因MYST1、MYST2、MYST3、gcn5、hdaA和rpdA的表达模式，从而影响黄曲霉毒素生物合成基因的表达[7]。

在大多数情况下，采用物理和化学方法防治黄曲霉及毒素污染不仅效率低，还会使加工的食品营养受到损失，有毒化合物的残留物清除困难，或者产生抗药性的病原微生物，此外，过量使用化学制剂还会给生态系统带来危害。相比较而言，生物手段具有效率高、覆盖范围广、可保证食品安全、维护生态环境等优点。因此，利用生物手段防治真菌污染是一种新兴的、可持续的策略。除利用植物源活性物质来减少农作物真菌污染外，还可以通过拮抗菌株或其次级代谢产物对病原菌进行生物防治[8]。在分子水平，可利用抗性相关基因标记辅助育种和基因工程技术开发拮抗黄曲霉菌新品种[9]。另外，利用代谢转化或吸附剂对黄曲霉毒素进行脱毒也是一种防治方法，还可以利用微生物中的有效成分将黄曲霉毒素降解为毒性较低的物质，使农产品的污染降低到最低限度。

目前，在抑制黄曲霉生长及降解黄曲霉毒素领域中，研究热点多集中在利用生物防治来实现，包括采用植物精油和拮抗微生物，此外，黄曲霉毒素的生物降解亦是目前的研究热点。

本文对产毒黄曲霉防治及对黄曲霉毒素具有降解作用的微生物种类、拮抗微生物代谢产生的有效成分、对黄曲霉的抑制机制和对黄曲霉毒素的降解情况进行了总结阐述，希望为生物防治黄曲霉及黄曲霉毒素污染提供参考。

1 黄曲霉及黄曲霉毒素的拮抗微生物

微生物是天然产物的重要来源之一，被广泛用于控制黄曲霉及黄曲霉毒素污染。研究发现，越来越多的微生物产生的代谢产物具有拮抗黄曲霉及毒素活性，因此，微生物代谢产生的有效成分在生物防治黄曲霉及黄曲霉毒素污染上具有广阔的应用前景。据报道，不同微生物及产生的代谢产物已被作为潜在的抑制黄曲霉的活性物质进行研究，包括芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、链霉菌、木霉、假单胞菌和一些海洋微生物、非产毒曲霉及其产生的代谢产物。

1.1 芽孢杆菌

芽孢杆菌对黄曲霉及黄曲霉毒素具有显著的抑制作用，从土壤中分离出的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)对黄曲霉生长有较强的抑制作用，抑制率均在90%以上[10]。萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)发酵液的上清液中含有一种或几种次级代谢产物，具有拮抗黄曲霉的作用[11-12]。此外，巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)和蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)也具有一定的抗黄曲霉活性[5,13]。

1.2 乳酸菌

乳酸菌作为一种益生菌，常被用来控制真菌毒素的产生，其中植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)被广泛用于控制黄曲霉的生长，有研究表明：从泰国发酵米粉中分离出的植物乳杆菌K35(LactobacillusplantarumK35)几乎可以完全抑制黄曲霉的生长[14]。

1.3 酵母菌

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的应用较为广泛，可分泌酶类等物质对黄曲霉的菌丝生长及黄曲霉毒素的合成产生显著影响，类似的还有异型毕赤酵母(Pichiaanomala)[7,15-16]。

1.4 链霉菌

笔者研究团队从土壤中分离出的白黄链霉菌TD-1(StreptomycesalboflavusTD-1)通过产生挥发性物质来抑制黄曲霉分生孢子的形成，下调黄曲霉毒素生物合成基因的表达水平，从而直接减少黄曲霉毒素的产生[17-18]。从水稻叶片分离出的阳陵链霉菌(Streptomycesyanglinensis)通过影响黄曲霉毒素的合成来达到几乎完全抑制黄曲霉菌丝生长的目的，具有有效的抗真菌活性[4,19]。

1.5 海洋微生物

海洋微生物也是抗真菌毒素研究领域的关注点之一，存在于海藻中的埃希氏菌(Enterobacterasburiae)、吡咯伯克霍尔德菌(Burkholderiapyrrocinia)和希瓦氏菌(Shewanellasp.)等微生物能对黄曲霉达到完全抑制的效果，研究发现，其是通过分泌挥发性物质来发挥作用[6，20-21]。

1.6 非产毒曲霉

一些非产毒曲霉对黄曲霉生长和黄曲霉毒素积累也有较高的生防效果，如：非产毒黄曲霉(Aspergillusflavus)[22]、非产毒黑曲霉(Aspergillusniger)[23]、非产毒寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)[24]、米曲霉(Aspergillusoryzae)[25]等。另外，已有研究发现，木霉(Trichodermasp.)、假单胞菌(Pseudomonassp.)等微生物及产生的代谢产物也能够明显抑制黄曲霉的孢子萌发和生长[26-27]。

许多微生物对黄曲霉的生长和黄曲霉毒素的合成产生一定影响。芽孢杆菌、乳酸菌、链霉菌、酵母菌、非产毒曲霉和一些海洋微生物都能显著的抑制黄曲霉生长。可以看出，细菌在拮抗黄曲霉方面占有一定优势，但链霉菌和海洋微生物对黄曲霉的抑制作用更强，但具体的应用效果还需进行评估。

2 微生物抑制黄曲霉及毒素污染的有效成分

微生物通过产生活性物质来对黄曲霉的生长和黄曲霉毒素的产生发挥抑制作用，其发酵液中的活性物质和产生的次级代谢产物是一类具有利用价值的天然产物。表1列出了各种微生物产生的活性物质及其对黄曲霉的抑制效果，这些活性物质主要包括多肽、细菌素、小分子有机物、有机酸、抗生素和酶。

表1 微生物代谢产物对黄曲霉及毒素有抑制作用的有效成分

2.1 芽孢杆菌产生的抗生素和蛋白酶

芽孢杆菌被广泛用于防治黄曲霉及黄曲霉毒素污染，可通过产生抑菌物质来发挥作用。芽孢杆菌霉素D是芽孢杆菌分泌的常见细菌素，赋予菌株较强的抗黄曲霉能力[11,28]。另外，解淀粉芽孢杆菌UTB2(BacillusamyloliquefaciensUTB2)和枯草芽孢杆菌UTB3(BacillussubtilisUTB3)产生的蛋白酶均对黄曲霉生长有很强的抑制作用，抑制率达90%以上[10]。近年来，在对巨大芽孢杆菌CGMCC7086(BacillusmegateriumCGMCC7086)研究中，新发现了3种多肽具有抗真菌活性[5]。此外，拮抗蛋白和抗生素也是芽孢杆菌中重要的抗真菌物质[5,12,29]。

2.2 乳酸菌产生的有机酸和多肽

乳酸菌代谢产物中含有一些具有抑菌活性的有机酸，其中乳酸的产量最高，可以完全抑制黄曲霉的生长[14]。其次，苯乳酸、羟基苯乳酸和吲哚乳酸也具有一定的抗真菌活性[30-31]。除有机酸外，植物乳杆菌IS10(LactobacillusplantarumIS10)产生的多肽也是一种对黄曲霉具有较强抑制作用的天然产物[32]。另外，还有从植物乳杆菌AF1(LactobacillusplantarumAF1)中分离出一种分子式为C12H22N2O2的酮类抗真菌化合物[33]。

2.3 酵母菌产生的几丁质酶

酵母菌常常被用来作为防治黄曲霉及黄曲霉毒素污染的微生物，其中酿酒酵母117(Saccharomycescerevisiae117)应用最为广泛，其产生的挥发性物质对黄曲霉有明显抑制作用[15]。此外，异型毕赤酵母ATCC 34080(PichiaanomalaATCC 34080)产生的几丁质酶也能够影响黄曲霉的生长、黄曲霉毒素的产生及其基因表达[16]。

2.4 链霉菌产生的小分子有机物

链霉菌之所以成为重要的微生物资源，是因为其能产生丰富的次级代谢产物，如阿伐他汀A[34]和二辛糖苷A[35]等。最近研究发现，白黄链霉菌TD-1(StreptomycesalboflavusTD-1)产生的挥发性化合物——二甲基三硫醚和苯胺，能够完全抑制黄曲霉菌丝生长和孢子萌发以及黄曲霉毒素的产生[17-18]。从阳陵链霉菌3-10(Streptomycesyansingensis3-10)粗提物中分离纯化出的反转霉素A和B在生物防治黄曲霉及其毒素污染方面也发挥了重要作用[4，36]。此外，2-甲基异莰醇、2-甲基丁酸甲基酯和苯乙醇也几乎能够完全抑制黄曲霉毒素的产生[19]。

2.5 其他微生物产生的抑菌活性成分

研究发现，一些海洋微生物也可以通过分泌挥发性有机物来完全抑制黄曲霉生长，如：阿氏肠埃希氏菌VT-7(EnterobacterasburiaeVT-7)[6]、吡咯伯克霍尔德菌WY6-5(BurkholderiapyrrociniaWY6-5)[21]和海藻希瓦氏菌.YM8(Shewanellasp.YM8)[20]。另外，研究发现，哈茨木霉GIM 3.442(TrichodermaharzianumGIM 3.442)具有抑制黄曲霉生长的能力，从中分离的活性物质为重组天冬氨酸蛋白酶[26]。

大多数拮抗黄曲霉的微生物是通过产生活性物质来发挥作用，活性物质主要有多肽、细菌素、小分子有机物、有机酸、抗生素和酶等。其中，挥发性化合物的发现使防治黄曲霉污染工作的进行更加高效。但活性物质的种类仍有限，其产量也较低，这使得微生物抗真菌活性的应用难以快速发展。

3 微生物代谢产物对黄曲霉及毒素的抑制机制

微生物具有比表面积小、结构简单、繁殖速度快、代谢迅速等特点，因此，多种微生物及其代谢产物已被广泛用于黄曲霉及毒素的防控工作中，主要作用方式如下。

3.1 竞争抑制作用

产毒菌株在感染过程中被非产毒菌株置换而被物理排除，或者非产毒菌株竞争黄曲霉毒素生物合成所需的营养物质[8]。然而，使用非产毒曲霉菌种也有一些风险。由于曲霉菌的遗传多样性和遗传复杂性，非产毒曲霉菌可能会发生遗传突变，因此，从长期安全的角度出发，建议谨慎使用非产毒曲霉菌株[37]。

3.2 拮抗作用

解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶可通过改变黄曲霉细胞的通透性、渗入细胞质、破坏细胞器来影响真菌生长和黄曲霉毒素的产生[10]。类似地，在植物乳杆菌代谢产物中，含量最高的乳酸通过多个靶点对黄曲霉细胞壁和细胞膜造成破坏，从而发挥对黄曲霉的抑制作用[14]。解淀粉芽孢杆菌B10-6-1(BacillusamyloliquefaciensB10-6-1)产生的脂肽类抗生素以及空气芽孢杆菌Y-17-3(BacillusaeriusY-17-3)中的拮抗蛋白通过抑制黄曲霉菌孢子萌发和菌丝生长起到抑菌作用[29,38]。研究发现，哈茨木霉GIM 3.442(TrichodermaharzianumGIM 3.442)和荧光假单胞菌PB27(PseudomonasfluorescensPB27)中的活性物质对黄曲霉的作用机制均为抑制真菌菌丝生长和孢子萌发[26-27]。同样，由萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)分泌的拮抗蛋白也可以通过此方式发挥抑菌作用，可诱使黄曲霉菌丝发生变异[12]。一定条件下，还可以通过诱导花生分泌SOD酶、PAL酶、POD酶、PPO酶来抑制CAT酶的分泌，从而增强花生抗逆性[12]。某些微生物代谢产生的挥发性化合物具有覆盖广、见效快等特点，近年来也常被用来控制真菌病原体。一些链霉菌和海洋微生物可产生挥发性物质，来降低黄曲霉毒素生物合成基因表达，抑制黄曲霉毒素的产生，抑菌效果显著[6，19-21]。异型毕赤酵母ATCC 34080(PichiaanomalaATCC 34080)产生的酶类可以通过寄生和裂解作用使黄曲霉的菌丝受到破坏，另外，酵母菌也可以产生挥发性物质来抑制真菌产孢，对黄曲霉毒素抑制效果显著[7, 15-16]。从白黄链霉菌TD-1(StreptomycesalboflavusTD-1)中分离出的挥发性有机物能完全抑制黄曲霉的生长，研究发现，抑制机制为抑制黄曲霉分生孢子的形成，下调黄曲霉毒素生物合成基因的表达水平，破坏黄曲霉的细胞壁和细胞器[17-18,39-40]。

3.3 吸附和脱毒酶降解作用

大多数乳酸菌被用作益生菌，通常将其作为去除黄曲霉毒素的理想微生物，其中，已对鼠李糖乳杆菌GG(LactobacillusrhamnosusGG)的物理吸附作用进行了研究[41]。除物理吸附外，还可以利用微生物中的一些蛋白质或酶将黄曲霉毒素降解成毒性较低的物质。表2列出了各种微生物及其代谢产物对黄曲霉毒素的降解条件、降解产物及降解效果。研究发现，地衣芽孢杆菌BL010(BacilluslicheniformisBL010)培养物上清液中的两种降解酶能有效降解黄曲霉毒素B1，对转化产物进行了检测和鉴定，确定其分子式为C12H14O4[42]。类似地，蔬菜芽胞杆菌GX01(BacillusoleroniusGX01)和绒毛芽孢杆菌DY3108(BacillusvelezensisDY3108)对黄曲霉毒素B1的降解能力均与培养物上清液中的胞外蛋白或胞外蛋白酶有关[43-44]。另外，沙氏芽孢杆菌L7(BacillusshackletoniiL7)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)和枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)均对黄曲霉毒素B1具有较强的降解作用[45-46]。酵母菌在食品中的应用已有多年的历史，据报道，假丝酵母CGMCC3790(CandidaversatilisCGMCC3790)降解黄曲霉毒素B1的能力显著，并且4种降解产物均无毒性，其降解物质可能为胞内组分[47]。假单孢菌中的胞内酶或胞外酶均能使菌株产生降解黄曲霉毒素B1的能力[48-49]。还有一些大肠杆菌CG1061(EscherichiacoliCG1061)、镰刀菌WCQ3361(Fusariumsp.WCQ3361)、尿毒杆菌CCTCC M 2015181(CladosporiumuredinicolaCCTCC M 2015181)均能有效地消除黄曲霉毒素B1[50-52]。酿酒酵母RC016(SaccharomycescerevisiaeRC016)，布拉酵母RC009(SaccharomycesboulardiiRC009)和马氏克鲁维菌VM003(KluveromycesmarxianusVM003)除具有降解黄曲霉毒素B1能力外，也对黄曲霉毒素 M1具有降解作用，降解率均在80%以上[53]。

表2 微生物代谢产物对黄曲霉毒素的降解情况

在实际应用中，若培养体系中营养丰富，菌株的降解效果会更好。嗜盐拟青霉CGMCC 3792(TetragenococcushalophilusCGMCC 3792)中的胞内酶通过先吸附后生物降解来消除黄曲霉毒素B1，对酱油渣中黄曲霉毒素B1的降解率达91.99%以上[54]。枯草芽孢杆菌UTBSP1(BacillussubtilisUTBSP1)产生的胞外酶对开心果中黄曲霉毒素B1的去除率高达95%[55]。

4 结论与展望

食品和粮食中的黄曲霉毒素污染对经济发展和公共卫生安全都造成了严重的威胁，因此，需要寻找有效的控制方法。目前，化学防治黄曲霉及其毒素污染仍是主要方法，但真菌的抗药性、化学药品残留和环境污染等问题严重限制了化学防治方法的应用。随着现代生物技术的迅速发展，人们逐渐采用更安全、高效、环保的生物防治方法对霉菌污染进行防控。利用微生物对黄曲霉及毒素污染进行防治是最具有潜力的方法。在现有研究中，分离到对黄曲霉有抑制作用的微生物主要有芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、链霉菌、木霉、假单胞菌和一些海洋微生物，它们可通过产生活性物质来抑制黄曲霉的生长，活性物质主要包括多肽、细菌素、挥发性有机物、有机酸、抗生素和酶。抑菌机制主要为非产毒黄曲霉菌对产毒黄曲霉菌的竞争抑制作用、微生物通过产生次级代谢产物来抑制黄曲霉的生长、微生物对黄曲霉毒素的物理吸附和脱毒酶降解。其中，利用微生物产生的蛋白质或酶类物质将黄曲霉毒素降解为毒性较低的物质，成为防治黄曲霉毒素污染的一个重要方法。

筛选对黄曲霉及毒素具有拮抗作用的菌株是防治黄曲霉污染领域中的研究热点之一。在各种微生物中，链霉菌作为一种普遍存在于土壤、植物、空气中的微生物资源，具有复杂的次级代谢途径，所产生的次级代谢产物已广泛用于基础医疗、农业、生物、化学等领域，其抑菌活性显著，对黄曲霉及黄曲霉毒素具有显著的抑制效果，在控制黄曲霉及毒素的研究和应用中具有广阔的发展前景，因此，应加强链霉菌代谢途径及其产生的可抑制或降解对黄曲霉及毒素代谢产物的研究，有利于真菌毒素的防控工作。经过多年的研究，本团队从自然界分离的具有自主知识产权的白黄链霉菌TD-1及其产生的代谢产物对多种丝状真菌有明显的抑制作用，最近的研究发现，该微生物可产生帕马霉素，对产毒黄曲霉的抑制活性比较明显，另外，其产生的挥发性物质几乎可以完全抑制黄曲霉毒素的产生。在国家自然科学基金的资助下，目前正积极开展链霉菌TD-1拮抗产毒黄曲霉及毒素机制的研究。大量分离微生物中的抗真菌活性物质，深入研究其对黄曲霉及毒素的抑制机制是今后防治真菌毒素污染的重要基础研究工作。利用生物防治法解决农作物和农产品中黄曲霉及毒素污染问题，对提高食品安全性具有重要意义。