何畅 ，李达，高岩松，刘佳彤，苏颖*，王景会*

1. 吉林省农业科学院农产品加工研究所（长春 130033）；2. 吉林农业大学食品科学与工程学院（长春 130118）

分蘖洋葱（Allium cepavar. Aggregatum）又被称为鬼子葱，东北人称之为分蘖葱头，它属于百合科的一种植物，属于草本类植物，具有球形的外形，被赤红色的皮膜包裹着。分蘖洋葱以蔬菜方式销售并远销世界各国，因在加工方面不够深入，技术含量非常低且产品附加值不高，导致具有丰富营养价值的分蘖洋葱被忽视。现代临床医学证实分蘖洋葱具有抑制细菌增长[1]，降低血糖[2]和血脂含量，抑制血小板凝固[3]等功效，并且在各种疾病方面有很好疗效[4]，对软化脂肪中的血管分蘖洋葱的疗效作用更加显著。

微胶囊是一种将固体、液体或气体包封形成微小粒子的保护技术，可以在保留芯材物质原有特性的前提下实现其缓慢释放、瞬间释放或持久保存，在功能材料领域应用广泛[5]。微胶囊技术可赋予产品优良的阻隔及缓释特性，同时有效改善芯材的颜色及风味不佳的情况，使其在食品领域中得到广泛应用，成为国内外专家研究热点[6-7]。大多数气体、液体、固体均可被包囊。近年来，针对精油[8]及多肽[9]等进行微胶囊的研究较多，而黄酮类化合物相关研究主要集中于提取[10]、纯化[11]等方面，以海藻酸钠为壁材通过锐孔凝固浴法包埋分蘖洋葱黄酮微胶囊仍鲜见报道。

因此，试验以分蘖洋葱黄酮为芯材，海藻酸钠为壁材，通过响应面法优化锐孔法制备分蘖洋葱黄酮微胶囊工艺，在提高黄酮稳定性的同时，也能扩大其应用范围。将分蘖洋葱黄酮微胶囊进行品质分析，探究黄酮微胶囊理化特性及缓释效果，为其在食品领域应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

分蘖洋葱黄酮（实验室自制）；海藻酸钠（浙江一诺生物科技有点公司）；吐温80（酷尔化学科技（北京）有限公司）；胰蛋白酶、胃蛋白酶（上海蓝季科技发展有限公司）；无水氯化钙、磷酸二氢钾、氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇、盐酸（南京化学试剂股份有限公司）。

1.2 仪器与设备

恒温水浴锅（HH-2，常州朗越仪器制造有限公司）；磁力搅拌器（78HW-1，杭州仪表电机有限公司）；冷冻干燥机（FD-1PF，北京德天佑科技发展有限公司）；紫外分光光度计（Cary50，美国VARIN公司）；蔡司（ZEISS）扫描电镜（evo18，德国卡尔蔡司公司）。

1.3 方法

1.3.1 制备工艺

无水氯化钙为凝固浴↘

海藻酸钠完全溶解→加分蘖洋葱黄酮与乳化剂吐温80→混合均匀→锐孔造粒→固化→分离洗涤→湿囊→干燥→成品

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 海藻酸浓度对包埋率的影响

分别配制浓度1%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%的海藻酸钠溶液，添加一定量分蘖洋葱黄酮冻干粉，使得芯壁比1∶3（g/g），缓慢向其加入1.3%吐温80，继续搅拌至黄酮完全溶解形成混合液，将装有混合液的烧杯放置在45 ℃水浴锅中；配制氯化钙浓度1.5%凝固浴，置于4 ℃下冷藏；用0.6 mm注射器吸取适量混合溶液，以较快速度推动活塞，但要维持注射器滴下的液滴为明显颗粒，滴入凝固浴氯化钙溶液中，造粒结束后置于4 ℃下固化45 min；经过滤、洗涤、干燥制得黄酮微胶囊，考察其包埋率。

1.3.2.2 芯壁比对包埋率的影响

配制2%海藻酸钠溶液，芯壁比分别为3∶2，2∶1，1∶1，1∶3和1∶5（g/g），加入1.3%吐温80，将混合液放置在45 ℃水浴锅中；配制氯化钙浓度1.5%凝固浴，置于4 ℃下冷藏；后续步骤同1.3.2.1。

1.3.2.3 氯化钙浓度对包埋率的影响

配制2%海藻酸钠溶液，芯壁比1∶3（g/g），缓慢向其加入1.3%吐温80，将混合液放置在45 ℃水浴锅中；分别配制氯化钙浓度为1.2%，1.5%，1.8%，2.1%和2.4%的凝固浴，置于4 ℃下冷藏；后续步骤同1.3.2.1。

1.3.2.4 乳化剂用量对包埋率的影响

配制2%海藻酸钠溶液，芯壁比1∶3（g/g），缓慢向其分别加入0.6%，0.8%，1.0%，1.2%和1.4%乳化剂吐温80，将混合液放置在45 ℃水浴锅中；配制氯化钙浓度1.5%凝固浴，置于4 ℃下冷藏；后续步骤同1.3.2.1。

1.3.2.5 水浴温度对包埋率的影响

配制2%海藻酸钠溶液，芯壁比1∶3（g/g），加入1.3%乳化剂吐温80，将装有混合液的烧杯分别放置在35，40，45，50和55 ℃水浴锅中；配制氯化钙浓度1.5%的凝固浴，置于4 ℃下冷藏；后续步骤同1.3.2.1。

1.3.3 响应面法优化微胶囊工艺试验

依据单因素试验结果，海藻酸钠浓度、芯壁比、氯化钙的浓度和乳化剂用量对微胶囊包埋率影响较大，应用Design-Expert 8.0.5 b软件，进行采用4个因素三水平的响应面优化，以微胶囊包埋率为响应值，重复试验3次。响应面设计编码值与因素设计见表1。

表1 响应面设计编码值与因素

1.3.4 包埋率计算

1.3.4.1 黄酮含量测定

黄酮含量测定采用硝酸铝法[12]。在λ=510 nm处测定其吸光度。得吸光度A与质量浓度c（mg/mL）的回归方程A=9.345 4c-0.008 4，R2=0.999 2。

1.3.4.2 微胶囊包埋率测定

微胶囊包埋率的测定参考文献[13]，按式（1）进行计算。

式中：A为微胶囊表面黄酮含量，mg/g；B为微胶囊总黄酮含量，mg/g。

1.3.5 微胶囊理化指标

1.3.5.1 感官评价

将复合微胶囊放在无异味、光线充足的条件下，对微胶囊的色泽、气味、组织状态进行评价[14]。

1.3.5.2 粒径的分析

黄酮微胶囊化后的采用游标卡尺进行测定。

1.3.5.3 含水量的测定

含量的测定参照GB/T 5009.3—2016[15]直接干燥法测定。

1.3.5.4 密度的测定

将微胶囊通过漏斗倒入已知质量、体积的容器中，容器顶部成锥形后，用平板将锥形粉料轻轻推平，铺满顶部，称量容器和微胶囊总质量，按式（2）计算密度[16]。

式中：ρ为微胶囊密度，g/mL；m1为容器质量，g；m2为容器和微胶囊总质量，g；V为容器体积，mL。

1.3.5.5 流动性的测定

颗粒的流动性常用休止角表示，参照GB 11986—1989《表面活性剂 粉体和颗粒休止角的测定》[17]固定圆锥底法。

1.3.5.6 扫描电镜超微结构观察

将分蘖洋葱黄酮微胶囊样品用离子溅射器镀金膜，观察并拍照具有代表性的微胶囊颗粒形态[18]。

1.3.5.7 人工胃肠液的配制

依据2010年版《中国药典》附录相关方法，分别制备人工胃液及人工肠液[19]。

1.3.5.8 微胶囊在模拟胃肠液中的释放

取0.1 g干燥的微胶囊放至100 mL配制好的模拟胃肠液中，37 ℃下反应，定时取出1 mL，用0.45 μm微膜过滤，补充同量模拟胃肠液。将其稀释至100 mL，于510 nm波长下检测OD值，计算得出模拟胃液中黄酮含量，计算累积释放量[20]。

1.3.5.9 累积释放量计算

1.3.6 数据处理与分析

利用Origin Pro 8.0进行数据分析；采用Design- Expert 8.0.5 b软件进行响应面试验的设计、数据分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验分析

2.1.1 海藻酸钠浓度对包埋率的影响

由图1可知，海藻酸钠浓度对微胶囊包埋率的影响较为明显，海藻酸钠浓度1.6%时包埋率最高，随着浓度增加，包埋率反而下降，这是由于海藻酸钠浓度增高，导致挤压很难进行，需要加大压力[21]，增加造粒难度，而且产品易出现拖尾现象，形状也不规则。因此，制备分蘖洋葱黄酮微胶囊时，海藻酸浓度1.6%较适宜。

图1 海藻酸钠浓度对包埋率的影响

2.1.2 芯壁比对包埋率的影响

由图2可知，微胶囊包埋率随着壁材增加而逐步增加，芯壁比1∶2（g/g）时包埋率最高，随着壁材添加量继续增大，但是包埋率却降低。可能是由于壁材海藻酸钠与分蘖洋葱黄酮的结合达到一定程度时，继续添加壁材使其浓度过大，不利于壁材的固化[22]，造成包埋率减小，同时也会造成海藻酸钠的不必要浪费。因此，制备分蘖洋葱黄酮微胶囊时，芯壁比1∶2（g/g）较适宜。

2.1.3 氯化钙浓度对包埋率的影响

由图3可知，微胶囊包埋率随着氯化钙浓度增加而逐步升高，氯化钙浓度2.0%时包埋率最高，随着氯化钙浓度继续增大，但是包埋率却降低。可能是由于氯化钙浓度较低时，产品黏度较大，易胶黏结成团，且不易成型。氯化钙浓度过高时，微胶囊成型迅速，在内层固化前形成致密的交联结构，质地较硬，使囊壁变厚、变脆，阻碍Ca2+向微胶囊内层的继续扩散和内层的充分包埋，干燥时易发生破碎[23]。因此，凝固浴氯化钙浓度2.0%较适宜。

图2 芯壁比对包埋率的影响

图3 氯化钙浓度对包埋率的影响

2.1.4 乳化剂用量对包埋率的影响

如图4所示，微胶囊包埋率随着乳化剂用量增加而逐步升高，乳化剂用量1.0%时包埋率最高，形成的微胶囊大小、质地均比较均匀，结构致密。随着乳化剂用量增加，乳化剂黏度会增加[24]，并影响气味，而且其包埋率逐步下降。因此，制备分蘖洋葱黄酮微胶囊时，乳化剂用量1.0%较适宜。

图4 乳化剂用量对包埋率的影响

2.1.5 水浴温度对包埋率的影响

如图5所示，水浴温度对微胶囊包埋率影响较小，在一定范围内，随着水浴温度增加，海藻酸钠与钙离子结合成网状结构，聚合反应也会加剧[25]，在表面形成保护层。但温度过高，导致海藻酸钠与黄酮发生分子结构的改变，生物活性也会逐渐减弱。因此，制备分蘖洋葱黄酮微胶囊时，水浴温度40 ℃较适宜。

2.2 响应面法对工艺参数进行优化

在单因素试验结果基础上，从单因素中选择对微胶囊包埋率有相对显著影响的因素进行响应面法优化试验。试验方案设计及结果见表2。

图5 水浴温度对包埋率的影响

表2 响应面优化试验设计及结果

利用Design-Expert 8.0.5 b软件，建立海藻酸钠浓度、芯壁比、氯化钙浓度、乳化剂用量4因素数学回归模型：Y=75.50-0.12A-0.072B-0.87C+0.44D+ 2.28AB-0.75AC+2.15AD-0.71BC+0.76BD+0.055CD-3.28A2-2.58B2-3.15C2-3.35D2。

从表3可看出，一次项中，C（氯化钙浓度）、D（乳化剂用量）对黄酮含量的线性效应均极显著（p＜ 0.01），A（海藻酸钠浓度）、B（芯壁比）对提取黄酮含量的线性效应不显著（p＞0.05），二次项中，A2、B2、C2、D2影响均极显著（p＜0.001），AD、AC、AD、BD影响极显著（p＜0.01），BC影响显著（p＜0.05），CD影响不显著（p＞0.05）。此模型显著性检测p＜0.001，极显著；失拟项p=0.992 3，不显著，校正模型的相关系数R2=0.984 9，决定系数R2adj= 0.969 8，说明选用的模型与实际得出的数据拟合较好、误差小，能较好反映各因素与包埋率之间的关系。由F值可知，C（氯化钙浓度）、D（乳化剂用量）在试验范围内对包埋率的影响较大，A（海藻酸钠浓度）在试验范围内对包埋率的影响相对于B（芯壁比）较大些，而B（芯壁比）对包埋率的影响较小。

表3 回归模型方差分析

通过Design-Expert 8.0.5 b响应面分析软件求解回归方程，得到分蘖洋葱超声波提取黄酮适宜工艺条件：海藻酸钠浓度1.51%、芯壁比1∶3.03（g/g）、氯化钙浓度1.97%、乳化剂用量1.02%，在此条件下所得的理论包埋率75.578 6%。为方便试验操作，将上述条件修正为海藻酸钠浓度1.50%、芯壁比1∶3（g/g）、氯化钙浓度2.0%、乳化剂用量1.00%，进行验证试验，平行3次所得的包埋率的平均值为75.472%，与理论包埋率相差0.106 6%，由此可见实际值与理论值，该多元二次方程建立的响应面模型预测包埋率可行。

2.3 微胶囊理化指标分析

2.3.1 质量指标

从图7能够看出，分蘖洋葱黄酮微胶囊呈现淡黄色，这是因为黄酮本身具有颜色，进行微胶囊包埋后仍然呈现淡黄色。图7A为未干燥的湿微胶囊色泽均匀，呈饱满球形，并且大小均匀，粒径较大，为2.1± 0.2 mm；含水量92%。图7B为干燥后的微胶囊，状态呈现为颗粒状，颜色与黄酮纯化后冻干粉颜色基本一致，粒径0.6±0.1 mm、含水量2.29%、密度0.541 g/cm3、休止角32.91°。

图6 各因素交互作用等高线和响应面图

图7 未干燥的湿黄酮胶囊（A）及干燥后的黄酮微胶囊（B）

2.3.2 微胶囊产品表面超微结构的观察结果

从图8能够看出，（A）粒径大的微胶囊颗粒外形较圆整，表面无明显破洞，但凹凸不平。（B）、（C）粒径小的黄酮微胶囊颗粒表面细腻圆滑、没有大的褶皱、裂缝、空洞等不良的表面缺陷。（D）在50 000×显微倍数下，微胶囊颗粒外表面完整，外壁组织结构致密，但有细微的裂纹，可能是微胶囊在干燥后失去了水分导致胶囊壁的外壳较易受损[26]，其表面凹凸不平，可能是由于在干燥过程中，湿胶囊本身水分分布不均匀[27]，在干燥过程中易造成其产生这种现象。微胶囊产品表面超微结构照片可以看出微胶囊颗粒较完整[28]，可以证明微胶囊颗粒的成型性较好，从整体结构的成型及干燥后的形态可以看出，此最佳工艺包埋分蘖洋葱黄酮成型效果较好，并且包埋率也相对良好。所优化的微胶囊配方参数制得的黄酮微胶囊具有良好的微胶囊理化效果，证明响应面法得到配方的合理性。

图8 微胶囊产品表面超微结构

2.3.3 胃肠液体外释放

通过体外模拟胃肠液试验测定分蘖洋葱黄酮微胶囊在胃肠液中的累计释放量，结果如图9。在模拟胃液中，微胶囊消化6 h后，其释放量累积达到7.476 0%；但在6～11 h范围内，释放量累积的速度明显变低，11 h时达到11.825%。以海藻酸钠为壁材的微胶囊在模拟胃液中具有较低的释放量与海藻酸钠的敏感性有关，海藻酸钠在较低pH条件下基本不溶胀，但在碱性条件下能溶胀。因而在胃液中的黄酮微胶囊受到海藻酸钠壁材的保护，故能阻止微胶囊芯材的释放[29]。同时其在肠液内的累计释放量大于胃液，在肠液内释放8 h后，累计释放量71.964%；在8～11 h范围内，相对于前8 h，释放速率增加开始减慢，释放11 h后累计释放量85.932%。故在模拟人工肠液中，微胶囊外壳溶胀破裂，使芯材释放。

制备的微胶囊的模拟体外胃肠液释放的试验结果表明，11 h后微胶囊在胃液中累计释放量11.825%，肠液中85.932%，可以看出其缓释效果较好。

图9 模拟胃肠液中黄酮累积释放量的变化

3 结论

试验以海藻酸钠为壁材，以分蘖洋葱黄酮为芯材，采用锐孔法制备黄酮微胶囊。根据单因素试验结果确定水浴温度对微胶囊包埋率的影响较小，故选海藻酸钠浓度、芯壁比、氯化钙浓度、乳化剂用量进行响应面优化，在确定操作温度为40 ℃时，最佳制备工艺参数：海藻酸钠浓度1.50%、芯壁比1∶3（g/g）、氯化钙的浓度2.0%、乳化剂用量1.00%，在此条件下，微胶囊包埋率75.472%；微胶囊粒径、含水量、密度及休止角分别为0.6±0.1 mm、2.29%、0.541 g/cm3和32.91°；经电镜法观察超微结构看出产品成形性较好，无漏洞，分布均匀。在模拟胃肠液体外释放时，在胃液中释放缓慢，而在肠液中能充分释放，有利于黄酮类化合物在人体内的消化吸收，为分蘖洋葱黄酮化合物研究奠定基础。