王欧洋

神经胶质瘤起源于中枢神经体系，发病率高，占原发性脑肿瘤35.26%～60.96%［1］，病理上多呈浸润性生长，手术难度大，较难分辨出真正的肿瘤边界，放疗辐射耐受程度可能会引起残余病灶复发。长链非编码RNA（long non coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度＞200核苷酸的RNA，本身无蛋白质编码能力，近年来国内外研究表明，lncRNA参与中枢神经系统的表达，已有研究表明lncRNA在胶质瘤中存在异常表达［2］；lncRNA UCA1促进胶质瘤的生长，且可通过靶向miR-122发生转移［3］。lncRNA CCAT1在抑制细胞凋亡的同时抑制miR-410，促进胶质瘤细胞的增殖。lncRNA SNHG1通过调节、迁移和凋亡促进胶质瘤的发展，可评估预后程度［4］。lncRNA TP73-AS1与miR-142相互作用，促进胶质瘤细胞的增殖。loc728196是一种新型lncRNA，但目前国内外尚无关于lncRNA loc728196与人脑胶质瘤的相关性研究。因此，本研究将实验证明lncRNA loc728196/miR-513c轴通过靶向TCF7促进胶质瘤的发生。

1 材料与方法

1.1 细胞系及细胞培养 四种胶质瘤细胞系（U87、U251、LN229和A172）和人星形胶质细胞系（NHA）购自美国ATCC（American Type Culture Collection）。细胞培养在含有10%FBS的DMEM培养基中，且在37℃和5% CO2条件下培养。

1.2 细胞转染 小干扰RNA（si-LOC728196；5"-G AGACU AUAUUGUUAGUAAUA-3"）和短发夹状RNA （shRNA；5"-GAGACTATATTGTTAGTAATA-3"）由Invitrogen合成纯化。MiR-513c模拟物（5"-UUCUCAAGGAGGUGUCGUUUAU-3"），MiR-513c抑制剂（5"-AUAAACGACACCUCCUUGAGAA-3"）和阴性对照组（miR-NC；5"-UCACAACCUCCUAGAAA GAGUAGA-3"）均购于 GenePharma公司（Shanghai，China）。参照转染试剂 Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA） 的 说 明 书 步 骤， 将100nM siRNAs、miRNAs转染至细胞系中。在病毒生产方面，将sh-LOC728196序列克隆到pHBLV-U6慢病毒核心载体中（Hanbio，Shanghai，China）。

1.3 细胞增殖实验 2×103U251和A172细胞置于96孔板中培养24h、48h或72h。然后将CCK-8溶液（Beyotime，Shanghai，China） 加 入 细 胞 4h， 然后CCK-8法450nm波长处测定每组细胞吸光度值。1×103U251和A172细胞接种至6孔板的每一口中，孵育14d后，菌落用甲醛固定，用0.5%结晶紫（Sigma，USA）染色，然后用显微镜计数。

1.4 Transwell细胞迁移、侵袭实验 细胞迁移实验：将细胞组常规消化后，加入无血清的DMEM培养基制备1×108/L的细胞悬液。……