王丛阳，郭文文，王家俊，熊 林，金 宁，王 焱

结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，约有15%发生BRAF基因突变，而BRAF基因突变约90%为BRAF V600E突变。目前对BRAF V600E突变的检测手段有两种：免疫组化和分子检测，分子检测目前应用较多的是荧光定量PCR技术。本实验应用免疫组化和实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)技术对结直肠癌标本BRAF V600E突变状况进行检测，并对这两种检测方法结果进行分析，以期评价这两种方法在结直肠癌中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2018年1月～2019年12月南京医科大学第二附属医院病理科存档的结直肠癌标本113例，其中男性65例，女性48例，平均年龄69岁。113例结直肠癌标本均同时行免疫组化和qRT-PCR检测BRAF V600E的突变状况。

1.2 试剂(1)免疫组化试剂：BRAF V600E鼠单克隆抗体(克隆号VE1)、Opti View DAB免疫组化检测试剂盒、苏木精染液、返蓝染液均购自美国Roche公司。(2)qRT-PCR试剂：核酸提取试剂盒、人类BRAF V600E突变检测试剂盒均购自厦门艾德生物公司。

1.3 方法

1.3.1免疫组化 手术标本均经10%中性福尔马林固定12～48 h，常规全自动脱水机脱水，石蜡包埋，经全自动切片机3～4 μm厚切片，60 ℃烤片1 h，Ventana全自动免疫组化仪上机检测。BRAF V600E检测全自动免疫组化的设置流程：脱蜡76 ℃ 16 min；修复100 ℃ 64 min；一抗孵育37 ℃ 24 min；苏木精37 ℃ 8 min；返蓝37 ℃ 4 min。全自动染色结束后，将染色后的玻片放在加入洗涤剂的水中清洗，以去除玻片上的油膜，常规脱水、透明、封片，显微镜下观察。结果判读：BRAF V600E蛋白阳性细胞胞质呈棕黄色。

1.3.2qRT-PCR (1)DNA提取：经显微镜下观察，挑选肿瘤细胞占比>50%的组织蜡块，刮取6～8 μm厚组织4～5片至离心管中，二甲苯脱蜡后按照核酸提取试剂盒说明书提取基因组DNA，提取的DNA经紫外分光光度计测定其浓度和纯度，以确保OD260/OD280在1.8～2.0之间。检……